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Dr.

Antonio Barbadilla

Tema 10: Clonacin y


secuenciacin del DNA

Objetivos tema 10:


Clonacin y secuenciacin del DNA
Debern quedar bien claros los siguientes puntos:
Cmo se manipula el DNA?
Las endonucleasas (enzimas) de restriccin
Clonacin del DNA: DNA forneo, vector de clonacin,
organismo husped, seleccin de vectores
Vectores eucariticos
Organismos transgnicos
Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
Mapas de restriccin
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La secuenciacin del DNA
Dr. Antonio Barbadilla

Manipulacin del DNA


Estudio de una secuencia especfica de DNA que suele encontrarse
en un conjunto heterogneo de secuencias.
Aislamiento, amplificacin, secuenciacin y expresin de un
fragmento de DNA especfico
Esta tecnologa se denomina:
Tecnologa del DNA recombinante, clonacin gnica o
ingeniera gentica
Ningn campo de la biologa ha permanecido igual tras esta revolucin tecnolgica

Propiedad bsica del DNA que permite su manipulacin:


El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La
extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificacin, aislamiento, clonacin,... De fragmentos de
DNA complementarios a uno dado

Dr. Antonio Barbadilla

Herramienta bsica
Endonucleasas (enzimas) de restriccin -> Enzimas de bacterias
que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el
esqueleto azcar-fosfato.
Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)
Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palndromes
5-GGATCC- 3
3-CCTAGG- 5

Dr. Antonio Barbadilla

EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dr. Antonio Barbadilla

Dos tipos de cortes:


Corte plano:
extremos romos
Corte escalonado:
extremos pegajosos o
cohesivos

Herramienta bsica

Las enzimas de restriccin tipo II:


Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en
secuencias especficas, produciendo por tanto una poblacin
heterognea de fragmentos de extremos idnticos

Dr. Antonio Barbadilla

Clonacin del
DNA
DNA forneo (secuencia que
se desea clonar)
Vector de clonacin
(vehculo)
Organismo husped (E. Coli)
Seleccin de vectores

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Vector
hbrido

Vectores
hbridos
(quimera)

C
l
o
n
a
c
i

Fragmentos de
distintas
procedencias que
se unen in vitro
tras cortarse con
la misma enzima
de restriccin.
Ligasa sella zona
hbrida

d
e Vectores de
l

clonacin

D
N
A

Plsmido (1 sitio
de corte) 2-15 kb
Fago
(Lambda)
Csmido

Dr. Antonio Barbadilla

C
l
o
n
a
c
i

Vectores de
clonacin
Fago (2 sitios de
corte) < 24 kb

d
e
l
D
N
A

Cromosomas
artificiales P1
(derivados del
bacterifago P1,
pueden aceptar
insertos de 80 y 100
kb

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Fago

Vectores de clonacin

C
l
o
n
a
c
i

Csmido: extremos cos + DNA plsmido (origen replicacin)


+ DNA forneo + cpisde. ~50 kb
BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plsmido
F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Csmido

d
e
l
D
N
A

Dr. Antonio Barbadilla

C
l
o
n
a
c
i

Husped: E. coli
Insercin del vector hbrido en el husped:
Plsmido: transformacin (solucin diluida
cloruro de calcio) y replicacin autnoma
Fago (transduccin, insercin en DNA
husped)

d
e
l
D
N
A

Dr. Antonio Barbadilla

Csmido (transduccin como fago y


replicacin como plsmido)

Seleccin de vectores hbridos

C
l
o
n
a
c
i

Plsmido: resistencia a antibiticos

d
e
l
D
N
A

Dr. Antonio Barbadilla

Fago : Insercin en E. coli (slo se puede

Obtencin de la secuencia que se


clona

C
l
o
n
a
c
i

Un gen
Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
intrones): uso de la transcriptasa inversa que
hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
humana recombinante en bacterias)
Sntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacdica se puede
hacer DNA con la ayuda del cdigo (no regin
promotora ni controladora de la expresin)
~100bp

d
e
l
D
N
A

Fragmentos del genoma por digestin con enzimas


de restriccin (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
Se obtiene genoteca, juego completo
fragmentos clonados del genoma del organismo

Dr. Antonio Barbadilla

Vectores eucariticos

Permite obtener las mximas ventajas de genes eucariotas


Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de
levaduras (YACs):
Plsmidos + Secuencia replicadora + centrmero de
levadura + (telmero levadura)
Puede incorporar ms de 500 kb de DNA

Resistencia a antibitico
(p.e., ampr)

Origen de replicacin
del DNA de levadura
(ARS)
Regin centromrica
(CEN)

Origen de replicacin
bacteriano (ori)

Linealizacin (con
endonucleasas) y adicin
de extremos telomricos

Telmero

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ampr

ori

CEN ARS

Telmero

Transfeccin:

Introduccin de DNA forneo en eucariotas


Organismo transgnico: un eucariota con DNA forneo
Mtodos transfeccin
Clulas eucariotas toman DNA forneo del ambiente con
fosfato clcico (poco eficiente)
Inyeccin en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma
(ratones transgnicos 15% eficiencia)

Dr. Antonio Barbadilla

Mtodos transfeccin
Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
forneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infeccin
viral)

Dr. Antonio Barbadilla

Mtodos transfeccin
Electroporacin: se usa corriente elctrica para
introducir DNA
Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesculas de
membrana artificial)
Biolstica (mitocondrias y cloroplastos): disparo de
proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA

Plsmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y


elementos mviles (Elemento P en Drosophila)

Dr. Antonio Barbadilla

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto


heterogneos de fragmentos

Poblacin de fragmentos

Dr. Antonio Barbadilla

Separacin fragmentos

Reptacin
de los
fragmentos
a travs del
gel de
agarosa
Dr. Antonio Barbadilla

DNA teido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV
Dr. Antonio Barbadilla

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto


heterogneos de fragmentos

Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes


fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

Transferencia en Southern (Southern blotting)


Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA

Dr. Antonio Barbadilla

Transferencia en
Southern
(esquema resumen)

Dr. Antonio Barbadilla

Mapas de restriccin
mediante
enzimas de restriccin

Dr. Antonio Barbadilla

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin


(RFLP)

Dr. Antonio Barbadilla

La reaccin
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)

Dr. Antonio Barbadilla

Dr. Antonio Barbadilla

Dr. Antonio Barbadilla

Secuenciacin

Usos de la PCR

DNA fsil (evolucin,

arqueologa, historia) DNA traza


Fsiles
Mamut lanudo (40000
aos)
Abraham Lincoln
(sndrome de Marfan,
afecta tejido conectivo,
fribrilina)
Dr. Antonio Barbadilla

Hombre Neandertal ->


Hablaba como nosotros?

Secuenciacin de DNA
La secuencia nucleotdica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento ms completo de la estructura y
funcin de un gen.
La base molecular de mutaciones especficas
en un gen pueden investigarse
Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
La comparacin de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolucin molecular
Secuenciacin de genomas: estructura del
genoma

Disoxi

Mtodos:
Secuenciacin manual (inicial)
Qumico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
Dr. Antonio Barbadilla

Secuenciacin automatizada (1986,)

Didesoxi

Secuenciacin del DNA

Dr. Antonio Barbadilla

Secuenciacin automatizada del DNA

Dr. Antonio Barbadilla

Dr. Antonio Barbadilla

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Dr. Antonio Barbadilla

Animaciones de tcnicas de la gentica


http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

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