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Les milieux de

culture
L ensemencement

Dfinition

Les milieux de culture sont des mlanges de


substances, qui sont capable dassurer la
multiplication des bactries dans le
laboratoire.
Les lments de bas entrant dans la
prparation des milieux de culture:
- Leau
- Les sel minraux
- Les nutriments ( constitutifs et
nergtiques)

Attention !!
Le

milieu doit assurer les


conditions optimales pour le
mtabolisme bactrien (ph,
pression osmotique, arobie
ou anarobie, potentiel
redox) et il doit tre sterile.

Les nutriments

Peptones: sont des produits issue de


hydrolyse de protines
Infusion au extrait de viande: base
des bouillons de culture
Mlanges de protines natives:
loeuf, le srum du sang ou le sang
sans la fibrine

Les agents solidifiant


Lagar-agar

( extraite

dalgues)
Autres agents solidifiant : la
glatine, le gel de silice, les
oeufs coaguls (pour le
milieu Lwenstein-Jensen), le
srum coagul

Un milieu minimum est un milieu


comportant les lments chimiques
strictement ncessaires la
croissance bactrienne, sous une
forme utilisable par des bactries
n'ayant pas d'exigence particulire

Composition d'un milieu minimum:


Une source de carbone et d'nergie, gnralement le
glucose.
Une source de potassium et de phosphore: K2HPO4
Une source d'azote et de soufre: (NH4)2SO4
Une source de magnsium: MgCl2
Une source de calcium: CaCl2
Une source de fer: on emploie le citrate de fer (le citrate a
pour rle de maintenir le fer en solution)
Une source d'oligo-lements: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti
Une source d'eau, indispensable toute forme de vie: on
utilise l'eau distille (strile)
Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct
voire optimum: KH2PO4 par exemple
En l'absence de l'un de ces composants , les bactries ne
se dveloppent pas, car elles ne peuvent synthtiser ces
produits.

Caractristiques des milieux de culture

Les milieux de culture doivent pour permettre le


dveloppement des micro-organismes runir certaines
qualits. Ils doivent, en particulier:

- contenir en quantit suffisante tous les nutriments et


l'eau exigs par leur croissance et leur entretien et
respecter leur besoin en oxygne.

En effet, les micro-organismes sont classs en :


- arobies stricts qui ne se dveloppent qu'en prsence
d'oxygne. Une large surface de contact des milieux avec
l'air doit tre prvue;

- anarobies stricts qui prissent en prsence d'oxygne. La


surface de contact du milieu avec l'air doit tre aussi petite
que possible parfois mme recouverte d'une substance qui
l'en protge. Le milieu lui-mme peut tre priv de l'air
dissous par bullition ou additionn d'une substance avide
d'oxygne

Dans certains cas les cultures sont pratiques sous vide ou


dans une atmosphre de gaz inerte
- aro-anarobies facultatifs prsentant des caractres
intermdiaires donc des exigences moins grandes et en
particulier supportant l'oxygne

ATMOSFERA DE
CO2 5-10%

- tre ajust un pH prcis;


- tre port la temprature
optimale de croissance.
La croissance de certains microorganismes ncessite en outre soit des
substances particulires comme les
facteurs de croissance (comparables aux
vitamines), soit une atmosphre enrichie
en gaz carbonique.

Le bactriologiste utilise des milieux de culture


pour isoler les bactries du milieu qui les
contient, les identifier, tudier leurs proprits et,
ventuellement les conserver
Les milieux de culture utiliss peuvent tre
obtenus de diffrentes faons. Ils peuvent tre:
- Achets, conditionns, prts l'emploi. Cette
solution mme si elle est onreuse est valable que
pour les laboratoires ayant une consommation
limite et rgulire de milieux d'usage courant.
Elle s'impose le plus souvent pour certains milieux
dont la prparation est dlicate et complexe.

Prpars partir des diffrents ingrdients entrant dans


leur formule. La formule d'un milieu ressemble un peu
une recette de cuisine, chaque dtail de son excution
doit tre respect.
- Prpars partir de milieux secs dshydrats. Cette
technique permet de concilier une prparation simple,
rapide, pratiquement sans risque d'erreurs et un prix de
revient relativement bas.
- Prpars, juste au moment de l'utilisation sous leur
forme dfinitive. Certains milieux exigent, juste avant leur
emploi, l'addition de substances prissables, d'autres, un
conditionnement n'autorisant qu'un court dlai de
conservation, etc.

Prsentation des milieux en


botes de ptri

De nombreux milieux de culture doivent


tre, pour leur utilisation couls en
couche mince au fond de botes plates et
rondes en verre ou, le plus souvent en
matire plastique appeles botes de
Ptri. Le dlai de conservation des
milieux ainsi prsents n'excde pas trois
ou quatre jours aussi leur rpartition doitelle prcder de peu leur emploi.

La clasification des milieux


de culture

Selon ltat physique milieux liquides


- milieux solides

Selon leur composition: milieux usuels,


milieux avec des protines
natives, milieux
denrichissement, milieux slectifs, milieux pour
les anarobies, milieux pour les ractions
biochimiques

milieu liquide

milieux solides

Lagar nutritif

Classification des milieux


en fonction de leur
utilisation

On peut classer les milieux en 4


catgories:
- milieux usuels dits de base
milieux d'isolement
milieux d'identification
milieux de conservation.

Milieux usuels dits de base

Ces milieux permettent la culture d'une varit de


bactries aussi grande que possible, mais il n'existe pas
de milieu universel. Le choix d'un milieu usuel est en
gnral fonction de l'habitat naturel des bactries isoler
ou conditionn par l'examen microscopique direct du
produit tudi.

En bactriologie mdicale on utilise souvent des milieux


base d'extrait de viande pour la culture de la plupart des
microbes commensaux ou pathognes de l'homme et des
animaux.

Les milieux les plus utiliss sont le bouillon nutritif et la


glose nutritive (bouillon additionn de glose raison de 20 g
environ par litre).
Le bouillon nutritif est une macration de viande additionne
de peptones (15 20 g par peptones/litre) et lgrement sale
(5 g par litre). Les peptones sont obtenues en dgradant les
protines de tissus animaux ou vgtaux jusqu'au stade des
acides amins directement assimilables par les bactries.
En bactriologie agricole on utilise des milieux base de lait,
d'extraits vgtaux, etc.

Milieux d'isolement

Ces milieux, qui permettent d'obtenir les bactries


contenues dans un produit naturel l'tat de
culture pure, peuvent tre:
Les milieux de base usuels prcdemment cits.
- Les milieux de base enrichis de produits
biologiques: sang, supplments polyvitaminiques,
srum. Ces milieux enrichis facilitent l'isolement
des bactries fragiles et exigeantes partir des
produits pathologiques.
- Les milieux lectifs et slectifs qui favorisent la
culture d'une espce ou d'un groupe d'espces
bactriennes alors que la croissance des autres
bactries est difficile, entrave, ou nulle.

Les milieux d'identification

L'identification des bactries est surtout base sur


l'tude de leurs proprits biochimiques. Cette
tude est rendue possible par la culture de la souche
bactrienne sur un grand nombre de tubes de
milieux spciaux. On observe la modification des
milieux soit directement, soit grce des
indicateurs chimiques, puis on rassemble tous les
renseignements obtenus sous forme d'une fiche
signaltique qui permet d'tablir l'identit de la
bactrie en cause.
On appelle galerie bactrienne l'ensemble des
milieux permettant l'identification d'une bactrie.

galerie bactrienne (l'ensemble des


milieux permettant l'identification
d'une bactrie)

les principaux procds


d'ensemencement
ensemencement dans la masse

ensemencement par stries


transversales pour
dissmination:

ensemencement par stries


paisses

ensemencement par
inondation:

ensemencement par piqre


et par touche

Aspect macroscopique des


colonies bactriennes sur
les milieux gloss

l'il nu, on peut distinguer les


caractristiques d'une colonie:
La forme du relief
La taille
La couleur/la pigmentation( le pigment peut
tre localis aux colonie, par exemple: le
pigment blanc ou dore aux staphylocoques
L'aspect (collant, filamenteux...)
L'odeur
La transparence
L'allure des contours

Il existe trois grands types de colonies:


colonies de TYPE S (Smooth=lisse):
contours lisse et rguliers, semi-bombe,
surface brillantes, crmeuses.
colonies de TYPE M (Muqueux): contours
lisse et rguliers, trs bombes, surface
trs brillantes,filantes.
colonies de TYPE R (Rough=rugueux):
contours irrguliers, plates rugueuses et
mates, sches.

Colonies de TYPE S
(Smooth=lisse)

Colonies de TYPE R
(Rough=rugueux)
BACILLUS- GELOSE SIMPLE

BACILLUS (Gelose Sang)

GENRE CORYNEBACTERIUM

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
( Milieu Lowenstein )

Colonies de TYPE M
(Muqueux)

La pigmentation

Lhmolyse

Lhmolyse est habituellement


recherch sur une glose sang aprs
lensemencement;
Selon limportance de
lclaircissement, on parlera
dhmolyse alpha (incomplte), bta
(complte ou totale) et gama (sans
hmolyse)

Lhmolyse

incomplt
complte
ou totale

Colonie bombe et
aplatie