Obtencin de

enzimas
Mtodos de aislamiento y obtencin

Mtodos de aislamiento
Para la realizacin de un mtodo de aislamiento de una
enzima se debe de tomar en cuenta ciertos parmetros
como son los siguientes:
Propiedades fisicoqumicas
Estructura
Propiedades enzimticas
Propiedades biolgicas

Por qu se purifica?
Debido a que siempre las enzimas estn formando un
complejo en el interior de la clula como pueden ser las
siguientes:
Agregados moleculares
Complejos con otras enzimas
Protenas inertes
acidos nucleicos
Polisacaridos
Lipidos
Toda enzima que se purifica debe llevar un ensayo enzimtico para
valorar si procede o no.

Objetivos del aislamiento y

purificacin
Obtener un rendimientos mximo
Poseer una actividad cataltica mxima
Mxima pureza

Importancia de la localizacin
intracelular de la enzima
Enzimas en solucin verdadera en el citoplasma
Permanecen en el sobrenadante luego de la elimanacion de los componentes
particulados

La ruptura de las clulas en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio

Enzimas asociadas a estructuras celulares

Membranas, mitocondrias, etc pueden encontrarse en:
Solucion dentro de una membrana y puede ser extraida despus de la extracion de
la misma

Asociadas al material lipoproteico insoluble para pasarlas a solucin deb

disociarse el complejo

Condiciones de extraccin
Es necesario destruir a las clulas
Las estructuras subcelulares
Disociacin de enzimas de otras molculas
Uso de solucin con efecto mucoproteico o nucleoproteico

algunos de los complejos formados se pueden separar por

medios mecnicos pero otros necesitan de otros procesos
segn sea su naturaleza

Mtodos de purificacin
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Rotura celular
Precipitacin fraccionada por cambios de pH
Desnaturalizacin fraccionada por calentamiento
Precipitacin fraccionada con solventes orgnicos
Precipitacin fraccionada por sales
Absorcin fraccionada
Cromatografa en columna
Electroforesis

1.-Rotura celular

Homogenizacin mecnica
de vidrio
Mortero
Licuadora (complementados con abrasivos, bolitas de vidrio, solvente
*iso*hipertnico)

Homogenizacin snica
Ondas snicas o ultrasnicas (generan cambios de presin en la pared celular)

Desintegracin trmica
Congelamiento y descongelamientos rpidos y continuos

Desintegracin qumica
Agentes que atacan pared celular etanol, ter e isopentanol

Homogenizacin por deshidratacin

Precipitacin de protenas por solventes orgnicos *acetona en frio

conceptos
El soluto soluble se separa en forma de solidos insoluble en
una solucin

Mediante la accin de un agente precipitante

Temperatura
pH
Fuerza inica
Constante dielctrica del medio

Concentrar y purificar productos

Obtencin de productos proteicos y nucleicos
La precipitacin debe producir un soluto concentrado y relativamente puro
Los agentes precipitantes:

No deben producir desnaturalizacin del soluto

Deben proveer una mayor estabilidad del soluto en el precipitado que en la
solucin

 Ventajas de la precipitacin
Es relativamente barata
Se adapta a cualquier escala
Puede realizarse de forma continua
El equipo empleado es sencillo
En muchos casos los agentes precipitantes son baratos

2.- precipitacin por pH

La solubilidad de las protenas
globulares es ampliamente
influenciadas por el pH y fuerza
inica
En la ilustracin se observa la
solubilidad de protenas tpicas a
diferentes concentraciones de
sales

Disminucin de la solubilidad en el punto isoelctrico.

*Existe un pH llamado pH isoelctrico al cual la carga neta de la protena es cero
y la molcula es incapaz de desplazarse en un campo elctrico.

En el punto isoelctrico el efecto de las fuerzas electrostticas entre las

protenas es casi nulo. En estas condiciones la solubilidad de la protena es
mnima, y en consecuencia las molculas de protena tienden a unirse y a
precipitarse

* Cada protena tiene un

pH
isoelctrico
caracterstico por lo que la
precipitacin isoelctrica
puede utilizarse como una
operacin de purificacin
Seleccin
del agente precipitante
de protenas.
Se realiza a pHs cidos, debido a que los cidos
son baratos y varios de ellos como el fosfrico,
clorhdrico y sulfrico son aceptables en
productos alimenticios.
Desventaja:
* potencial de producir daos irreversibles a la
protena.

3.- desnaturalizacin por

calentamiento
La concentracin enzimtica
tambin depender la
temperatura con la que se
maneje dentro del
metabolismo de la clula
Temperaturas relativamente
altas provocan
desnaturalizacin generando
cadas en concentracin
enzimtica

Precipitacin por sales

La adicin de las sales elimina el agua de la protena
hidratada, dejando las regiones hidrofbicas en libertad
de combinarse intermolecularmente.
Las protenas que presentan mayor nmero de regiones
hidrofbicas sobre su superficie, forman agregados y
precipitan ms rpidamente que aquellas que presenten
pocas regiones hidrofbicas.

.- precipitacin por sales

La precipitacin de protenas
usando
sales
puede
representarse como una serie
de tres pasos:
1) Disolucin de la protena en
agua.
2) Se considera a dos molculas
de protena en solucin que
podran unirse al interactuar a
travs
de
sus
residuos
hidrofbicos, liberando agua.
3) Se agrega una sal a la
solucin, las molculas de agua
liberadas son atrapadas por la
sal, se producen agregados de
protena y stos precipitan.