UNIVERSIDAD DE LA HABANA

CURSO 2016-2017

ASIGNATURA CROMATOGRAFA
3ER AO CURSO REGULAR DIURNO
Tema I. Introduccin. Conf.2

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Tema I. Introduccin.
Conferencia No2: Parmetros cromatogrficos.
Sumario:
I.5. Definiciones y expresiones para el clculo de:

Tiempo bsico (muerto) (tM)

Tiempo de retencin (tR)

Tiempo de retencin ajustado (tR)

Factor de retencin o de capacidad (k)

Caudal (F)

Velocidad de flujo (u)

Coeficiente o constante de distribucin (K)

Retencin relativa (r)

Factor de separacin ( )

Resolucin (RS)

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Rememorar clase anterior

-Concepto de cromatografa. Definicin de la
IUPAC.
La Unin Internacional de Qumica Pura y
Aplicada (IUPAC) defini en 1973 el trmino
cromatografa.
La Cromatografa es un mtodo fsico de
separacin en el cual los componentes a separar
se distribuyen entre 2 fases, una que es
estacionaria (fase estacionaria) mientras que la
otra (fase mvil) se mueve en una direccin
determinada.

Qu

nombre en cromatografa reciben estas representaciones

grficas en funcin de la seal y frente al tiempo o volumen de
retencin?

Desarrollo.
I.5. Definiciones y expresiones para el
clculo de los diferentes parmetros
cromatogrficos.
Qu es un parmetro?
Parmetro: Es una cantidad o magnitud
que puede tener distintos valores y que
caracteriza un proceso, operacin o un
resultado.

PARMETROS PARA BANDAS INDIVIDUALES:

RELACIONES DE TIEMPO:
La situacin del pico queda especificada por la retencin.
La retencin: se define como el retraso que experimenta un analito en
la columna cromatogrfica en relacin con una sustancia inerte (trazador)
NO retenida y que est sometida a idnticas condiciones que la muestra
insertada en el sistema.
A menudo la muestra o la FM contiene una especie que no se retiene.
Cuando NO es as, este tipo de especies puede aadirse para facilitar la
identificacin de los picos. Hay textos que la denominan trazador.

TIEMPO BSICO O MUERTO (tM): es el tiempo necesario para que la

especie no retenida alcance el detector, en algunas ocasiones se
denomina tiempo muerto.
Explicar sobre el cromatograma.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Tiempo de retencin (tR)

tR = Tiempo de retencin
(t0) , tM = tiempo bsico o muerto
Int

Time

El

pico pequeo de la izquierda corresponde a una especie que

no es retenida por la columna (a menudo la muestra o la FM
contienen una especie que no se retiene).

Tiempo bsico (tM) o muerto: Es el tiempo que transcurre desde

que se inserta el trazador al principio del lecho cromatogrfico hasta
que EMERGE del mismo y alcanza el detector.

Cmo se calcula?

L
L
tM
tM
u

tM: tiempo bsico o tiempo muerto

L: longitud de la columna que est llena.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso


L

tR

TIEMPO DE RETENCIN (tR):

es el tiempo que transcurre
despus de la inyeccin de la
muestra hasta que el pico de
concentracin del analito
alcanza el detector (ver sobre
el cromatograma).

tR es siempre mayor que el tM

Para calcular el tR es necesario conocer la velocidad lineal promedio

de migracin del soluto ( )

L

tR

L: longitud de la columna que est

llena.

tR: tiempo de retencin.

TIEMPO DE RETENCIN
AJUSTADO (tR) para un analito es el
incremento de tiempo que transcurre
desde que aparece el pico de la FM y
el del analito. As pues se cumple
que: tR = tR + tM
Del

cromatograma se observa que

esos tiempos se toman a partir de los
mximos de los picos.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Cromatograma tipo y parmetros frecuentes:

(tM-tiempo bsico o muerto, tR-tiempo de retencin, tR-tiempo de
retencin ajustado, w-amplitud en la base del pico, h-altura de pico)

Factor de retencin o de capacidad (k). Un parmetro de

mayor importancia para caracterizar con ms propiedad a un
soluto en un sistema cromatogrfico es el denominado factor
de retencin o factor de capacidad.

Es adimensional
Parmetro importante que con frecuencia se utiliza para
describir las velocidades de migracin de los solutos en la
columna.

Se define como:

kA

tR t M
tM

Medida del tiempo que un compuesto

permanece en la FE en relacin con el
tiempo que permanece en la FM.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Factor de capacidad (k)

puede

variar entre 0 e
k=0 si el soluto no se retiene, por tanto ns=0
K= si el analito se retiene de forma irreversible n M tiende a
cero
k

Int

= (tR - tM ) / tM A clarar t0 y tM es lo mismo

k: Es la relacin entre el tiempo de retencin ajustado y el tiempo

(muerto/bsico). Por tanto, el tiempo de retencin absoluto
podra expresarse como:

Como

tR
k
tM

tR t R t M

kt M t R t M

tR kt M

t R t M (1 k )

t R t M (1 k )
Como

tM

L
L
t R (1 k )
u
u

O sea el tiempo de retencin generalmente se mide en unidades de

tiempo por conveniencia. Las unidades de volumen son ms exactas,
despus que se hacen las correcciones adecuadas.
Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

kA

tR t M
tM

tR y tM se pueden obtener de un
cromatograma

1.

Cuando kA << 1 la elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil

determinar con exactitud los tiempos de retencin.

2.

Cuando kA es del orden de 20 a 30 los tiempos de retencin sern

excesivamente grandes.

3.

Idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones en

que los factores de retencin para las especies de una mezcla oscilan
entre 2 y 10.
Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

RELACIONES DE VOLUMEN:

Las expresiones de tM, tR, k son vlidas para

las de volmenes de VM, VR y k.
En clase se explican las de tiempo y para
estudio independiente se dejan las de
volmenes pues son equivalentes.

En el caso de la Cromatografa de Lquidos de Alta Presin (HPLC),la

compresibilidad de la FM puede despreciarse, por lo que los volmenes
definitorios de la retencin simplemente se calculan mediante el producto de los
correspondientes tiempos (en minutos) por el caudal (F) expresando
generalmente en mL/min (V= t F).

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Asimismo pueden definirse:

a)

Volumen muerto o bsico (VM): Es el volumen que ocupa en la

columna la FM. Tambin le denominan volumen intersticial o
volumen interpartcula de la columna V t F
M

b) Volumen de retencin (VR): Es el volumen de la FM necesario para que se

produzca la elucin de un soluto.

VR t R F
c) Volumen de retencin ajustado (VR).

VR t R F
d) Factor de retencin (k): Se define igual que antes.

VR VR VM t R F
k

VM
VM
tM F
Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Flujo o Caudal (F): volumen de FM (VM)

que pasa por la columna por unidad de
tiempo (mL/min)

-Se mide a la salida de la columna a presin

y T (en K) ambientes

VM
F
tM

Por qu es importante medir y fijar el

valor de la velocidad de flujo durante
una separacin cromatogrfica?

[F] = ml/min (Anlisis de las unidades) implica :

Recordar que el Volumen de Retencin (VR), es

el volumen necesario de FM para que se
produzca la elucin del analito de inters.

VR
F
tR

F igualmente quedara VM = tM Fc implica

que tM = VM/Fc

Si F es constante VR= tRF, la expresin anterior quedara como:

Implica que:

tM

VM

Fc

VM
Fc
tM

El Flujo o Caudal tambin se puede expresar a partir de:

V R tR F

Como

V R
k
VM

Recordar que como:

V R kVM

Se puede calcular

Fc u Ac

VR V R VM
VR VM (1 k )

Donde u: velocidad lineal de flujo

de la FM.
Ac: rea de la seccin de la columna

: porosidad intersticial de la columna

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

VELOCIDAD LINEAL DE FLUJO O VELOCIDAD LINEAL DE LA

FM (u): Concepto ms terico. Es la velocidad lineal de la fase mvil
a travs de la seccin transversal media del lecho cromatogrfico o de
la columna. Seg IUPAC (u) Puede calcularse a partir del flujo en
la columna a la temperatura de la columna, Fc, el rea (Ac) y
la porosidad interpartcula.
.

Segn IUPAC

Fc
u
Ac

u: velocidad lineal promedio del movimiento

de las molculas de la FM.
Fc: flujo de la FM a la T de la columna.

: Porosidad interpartcula.
Ac: rea de la seccin transversal

En la prctica, u se calcula
usualmente dividiendo la
longitud de la columna llena (L)
por el tiempo de retencin de
un compuesto no retenido, tM.

L
u
tM

Vc
u
tM

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

COEFICIENTE O CONSTANTE DE DISTRIBUCIN:

La cte de distribucin es la concentracin de un compuesto en la FE,
dividida por su concentracin en la FM.
Amvil A estacionaria
AM AS
Se denomina KC (relacin cantidad de sustancia/volumen)

La constante de equilibrio K para este proceso se denomina:

Constante de Distribucin (KC),
la razn de distribucin
o Coeficiente de Distribucin
La IUPAC recomienda el empleo del trmino Coeficiente de Distribucin
en lugar del trmino antiguo ya en desuso, de coeficiente de reparto o
relacin de reparto.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

CS
KC
CM
Donde CS: es la concentracin molar del soluto en la FE.
CM: es la concentracin molar del soluto en la FM

Idealmente KC es constante en un amplio intervalo de concentracin de soluto;

de este modo CS es directamente proporcional a CM.
La cromatografa en la que es aplicable esta expresin es la cromatografa de
elucin lineal.
distribucin

gaussiana,

los tiempos de retencin son independientes de la cantidad del analito

inyectado.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

CS
KC
CM
KC

Wi(S)= cantidad del compuesto i en la fase

estacionaria.

Wi ( S ) / VS
Wi ( M ) / VM

Wi(M) = cantidad del compuesto i en la fase

mvil.
VS = Volumen de fase estacionaria.
VM = Volumen de fase mvil.

A partir de esto pueden obtenerse relaciones combinadas con los parmetros ya

vistos. As el valor de KC est relacionado con el volumen de retencin (VR) de un
compuesto y los volmenes de las fases estacionarias (VS) y mvil (VM) en la
columna.
ORIENTAR COMO TRABAJO INDEPENDIENTE

VR VM K CVS

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Cmo llegar a esta expresin?

VR VM K CVS
Se parte del concepto de constante de distribucin KC:

Wi ( S ) / VS
CS
KC

CM Wi ( M ) / VM

KC

Wi ( S )VM
Wi ( M )VS

Resolviendo ese cociente:

Siendo Wi(S)/Wi(M) : una relacin msica (k) o

factor de retencin.
y VM/VS : una relacin de fases denominada

Por tanto

K C k .

Despejando k (factor de retencin) queda:

KC
V
k KC S

VM

Tambin conocemos que el factor de retencin puede ser expresado en

funcin de los diferentes tiempos o volmenes segn convengan, en este
caso lo expresaremos en funcin de los volmenes:

VR VM
k
VM

Por tanto igualamos ambas expresiones de

k idem para una misma separacin.

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

VR VM
VS
KC
VM
VM

VR K C .VS VM

Despejo VR y se cancela VM
en ambos denominadores en trminos
diferentes, quedando:

Con esta expresin el volumen de retencin

total (VR) para un componente dado; se
conoce por el volumen de FM (VM) dentro de
la columna y el volumen de FE (VS),
considerando adems la cte de distribucin
(KC) en el tiempo de elucin.

Teniendo esto en cuenta resulta muy til, definir otro parmetro vlido para
analizar una separacin cromatogrfica que se denomina Retencin Relativa (r):

Asignatura Cromatografa. DraC. Nancy Martnez Alfonso

PARMETROS PARA BANDAS ADYACENTES:

Retencin Relativa (r):
Es la relacin entre el volumen o tiempo de retencin ajustado o neto o
el factor de retencin de un compuesto y los de un patrn en idnticas
condiciones.

V Ri
r
V R ( st )
Dependiendo de la posicin relativa del pico del patrn en el cromatograma, el
valor de r puede ser >, < o idntico a la unidad.
Si r>1: El compuesto desconocido sale atrasado (ms retenido), es decir
despus que el patrn o estndar.
Si r<1 implica que el compuesto desconocido sale adelantado (menos
retenido), es decir sale primero que el patrn o estndar.
Si r=1 implica que es el mismo compuesto, es decir que la sustancia
desconocida y el patrn coinciden.

PARMETROS PARA BANDAS ADYACENTES:

Especificidad o Selectividad ()

factor de separacin Cociente entre los factores de

capacidad (k) o factores de retencin de un par de picos,
cuando existe separacin su valor es mayor que uno y aumenta
cuando aumenta la separacin.
La selectividad de un sistema depende de la naturaleza de cada
uno de sus componentes, columna, fase mvil y muestra, de su
afinidad mutua y del modo en que interaccionan entre s.

Int
seal
A

= k2 / k1

= 2.1 / 1.5 = 1.4

Time

Factor de separacin (

) parmetro bandas adyacentes

De una columna para 2 especies A y B se define como :

KB

KA

Donde KB es el coeficiente de distribucin para la

especie ms fuertemente retenida.
KA es el coeficiente de distribucin para la menos
retenida o que eluye con ms rapidez.

Segn esta definicin

siempre es > 1:

Sustituyendo la ecuacin:

Y la anloga de B

En la ecuacin

k AVM
KA
VS

kA factor de retencin
KA coeficiente de distribucin

k BVM
KB
VS

KB

KA

Sustituir por las expresiones de kB y kA

Mtodos Cromatogrficos. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Se muestra una relacin entre el FACTOR DE SEPARACIN para 2 analitos y

sus factores de retencin:

kB

kA

Donde kB y kA son los factores de retencin

para B y para A respectivamente.

La sustitucin de la ecuacin

tR t M
tM

Para A y para B,
permite expresar el
factor de separacin
como:

Mtodos Cromatogrficos. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Permite llegar a una expresin donde la

determinacin del factor de separacin se
puede hacer a partir de un cromatograma
experimental calculando los tR y los tM.

(t R ) B t M

(t R ) A t M
Ejemplo de cmo utilizar el factor de selectividad y los factores de
retencin para poder calcular el poder de resolucin de una columna.

Mtodos Cromatogrficos. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Puede expresarse en funcin de los factores de retencin

de los tiempos de retencin ajustados.

(t R ) B k B (VR ) B

(t R ) A k A (VR ) A
1.

Recordar que siempre en el numerador va el parmetro del compuesto ms

retenido, por eso siguiendo el orden del alfabeto B es el ms retenido.

2.

El factor de separacin (
) siempre se debe medir en condiciones
isotermas. Si se utilizan las mismas FE y FM y la misma Temperatura de la
columna. Slo vlido para sistemas isocrticos cuando las condiciones
experimentales permanecen constantes.

3.

Siempre me da la posicin del pico cromatogrfico. Sus valores estn

entre valores mayores que 1 y menores que de 2 para que la separacin
sea eficiente 1 2
Mtodos Cromatogrficos. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Resolucin (Rs) Trmino que expresa la

eficacia de la separacin

La separacin es el objetivo primario de la cromatografa, as la

resolucin es la expresin cuantitativa de la calidad de dicha
separacin.

Rs = 2(tR2 tR1 )/(W2+W1) 1.5 ptimo (entre 2 picos adyacentes)

Rs medida del grado de separacin entre dos picos

Rs = 0 (sin separacin); Rs = 1 (separacin parcial);

Rs = 1.5 (separacin a lnea base)
Int Seal

Rs = 1.5
B

Trmino que expresa la eficacia de la separacin

Resolucin de picos (Rs)

La resolucin cromatogrfica se define como la relacin entre la distancia

generalmente en unidades de tiempo que separa a 2 picos cromatogrficos,
tR, y la media aritmtica de los anchos de la banda de ambos picos.

(t R2 t R1 )
Rs
Wb1 Wb 2

Rs

2(t R2 t R1 )
Wb1 Wb 2

2
Mtodos Cromatogrficos. DraC. Nancy Martnez Alfonso

Rs: constituye una medida cuantitativa de su capacidad para

separar 2 analitos, teniendo en cuenta no slo la separacin entre
picos (aspectos termodinmicos), sino tambin los anchos de
zona o banda (aspectos cinticos) que ocupan en el momento
de la deteccin.
Rs: es ms til y definitivo que el factor de separacin () para
caracterizar la eficacia separativa del sistema cromatogrfico.

Aplicaciones de la Resolucin

Resumen de los parmetros