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Lhybridation molculaire

Prpar par :

Bouhnik Soumaya
Benzine Roumaissa
Bouterfif Roufaida
Mekahlia Imene

Suivi par :
Mme azizi
Plan de travail :
-Introduction
-Dfinition
-Dnaturation et renaturation
*Dnaturation ou fusion dADN
* Renaturation ou hybridation dADN
-Les types dhybridation :
* Hybridation en milieu liquide
* Hybridation sur support solide
-Application de lhybridation sur support solide
* Technique de Southern-blot
* Technique de Nothern-blot
* Puce a ADN
*Hybridation colonie
INTRODUCTION

La gnie gntique cest lapplication


technologique de la connaissance de la
biologie molculaire dont les trois
techniques qui ont autoris lavnenement
du gnie gntique sont la coupure de
lADN par les enzymes de restriction , le
clonage molculaire et lhybridation
molculaire
Dfinition :
Lhybridation molculaire dsigne lensemble des applications
qui utilisent la reconnaissance spcifique dune
squence dacide nuclique (ADN et ARN) par une autre
squence qui lui est complmentaire.
Lorsque la deuxime squence est marque, elle est appele
sonde molculaire

Donc la sonde est un courte fragment dADN simple brin (dau


mains 15 nuclotides ) dont la squence est complmentaire
dune squence recherche et qui a t marque radioactivement
par la fluorescence ou chimiquement . Ce marquage permet la
dtection de la squence recherche aprs hybridation
Le duplex form est dtectable et le signal obtenu offre des
informations qualitatives et quantitatives sur la squence cible
dtecte
Lhybridation peut tre : ADN-ADN ou ADNARN

Lhybridation de lADN ou ARN


est base sur les proprits
dappariement des bases
complmentaires de ces
acides nucliques
DNATURATION ET RENATURATION DADN
Afin de bien maitriser les diffrentes techniques dhybridation,
il est ncessaire de savoir les paramtres intervenant dans la
dnaturation (fusion) et renaturation (hybridation) des acides
nucliques
1. Dnaturation ou fusion dADN
Cest la sparation des deux brins constitutifs par la cassure
des liaison hydrognes entre les bases et donc formation
dADN simple brin (monocatnaire) ; elle se fait soit par :
2. Agents chimiques: solution basique, lure (agent
dnaturant)
3. Agents physiques : la T est lagent le plus influencant sur la
dnaturation de lADN
Le phnomne de la dnaturation est brutal et coopratif:
chaque fois quon a une rupture de la liaison hydrogne, la
rupture de la prochaine liaison devient trs rapide et facile
Tm est la temprature de fusion dADN: correspond louverture
ou au droulement de
2. Renaturation ou hybridation dADN
Les brins dADN ont la capacit de se rassocier dans
certains conditions, en gnral, on parle de renaturation si
les deux brins ont la mme origine et hybridation si ils ont
deux origines diffrentes,
La rassociation des deux brins se fait par labaissement
lent de la temprature

Lhybridation est sous linfluence de plusieurs paramtres:

La concentration et le temps: si la concentration de lADN


augmente la probabilit de rencontre entre les brins dADN
augmente et le temps ncessaire diminue on parle dunit Cot

Cot = concentration dADN x t


Ou
Rot : concentration des hybride ADN/ARN x t
Courbe de Renaturation
La temprature: il faut diminuer la T pour rassocier mais il
faut choisir une temprature qui assure la formation des hybrides
stables avec un rendement lev
Gnralement de 15 25 la Tm

La T dtermine aussi la stringence et lefficacit de la raction


dhybridation :

La T dhybridation doit tre infrieure la Tm mais proche delle


pour slectionner les hybrides dADN les plus complmentaires,
plus la T dhybridation est proche de la Tm plus la raction est
stringente et plus elle sloigne de la Tm la raction dhybridation
devient moins stringente en favorisant aussi lhybridation des brins
moins complmentaires ,

Le formamide: diminue la Tm et augmente la stringence


Type dhybridations ?
Hybridation en milieu
liquide
Dans cette technique, lhybridation se fait dans une solution
tampon adquate, les squences dADN shybrident par
agitation thermique une T infrieure de 25 % de la Tm.
Dans ce cas, lhybridation est quantifie et dtecte par
plusieurs mthodes:
1. Spectrophotomtrie
La diminution de la DO 260 nm indique la formation des
hybrides
2. Mthode de nuclase S1

-La capacit de la nuclase S1 dgrader que lADN


monocatnaire est utilise, alors aprs dgradation il ne reste que
les hybrides (ADN double brin )

3. Hydroxyapatite
-lhydroxyapatite sont des cristaux de
phosphate de calcium, ils ont la capacit de fixer
lADN bi-catnaire (chromatographie daffinit)
- Aprs fixation , les hybrides peuvent tre lus
par une concentration de phosphate 0,5 M
- Cette technique permet de doser lADN
bicatnaire et monocatnaire qui reste libre
dans le milieu, ainsi que le rendement de
lhybridation,
Hybridation sur support solide

Elle consiste fixer ou immobiliser lADN cible afin de faciliter la


sparation des molcules dADN hybrides et le non hybrides et
empcher la rassociation des deux brins dADN cible

lavantage de la technique:
elle vite la rassociation de lADN cible
facilite la rvlation de lhybridation car elle utilise des sondes
(ou lamorce) radioactives ou marques chimiquement

linconvnient de la technique:

lhybridation est lente (10 fois plus lente par rapport


lhybridation en milieu liquide)
Quantification ou le calcul de rendement est difficile ou
impossible
Les supports utiliss pour immobiliser les acides nucliques cibles
(ADN ou ARN) sont :
1. Fixation sur gel de chromatographie
- On utilise par exemple la chromatographie d'affinit sur oligoT
pour purifier les ARN polyA+. On utilise un support de
chromatographie sur lequel on a fix des oligonuclotides ne
comportant que des T (oligoT).

- On passe sur la colonne une solution dARN totaux eucaryotes,


dans des conditions infrieures au Tm. Les ARN messagers
polyadnyls en 3 shybrident aux oligoT de la colonne.

- Pour dcrocher les ARN messager hybrids dans la colonne, il


suffit daugmenter le Tm par exemple en diminuant la
concentration de sel de la phase mobile et en chauffant.
2. Fixation sur membrane

Il y a plusieurs sortes de membranes :

1- Membrane de la nitrocellulose

Ce sont les premires membranes utilises, la fixation de


lADN se fait par haute force ionique ou par une forte T
(80C), cest une fixation irrversible.
2- Membrane en Nylon

La fixation est irrversible et elle se fait par T ou par lUV


(254 nm)

3- lamelle de verre

La fixation sur lamelle de verre seffectue grce des


linkers, des molcules fonctionnalises qui permettent
de lier des fragments dADN par leur extrmit laide
de liaisons chimiques covalentes.
Application de lhybridation sur
support
1. Technique solide
de Southern-Blot
1. L'ADN est coup par des enzymes de restriction qui coupent
des squences prcises (la digestion doit tre totale)
2. Le milieu de digestion est dpos sur un gel dlectrophorse. Les
fragments d'ADN se sparent, ils migrent plus ou moins vite en
fonction de leur taille, les plus petits migrent le plus vite.
3. Les fragments spars sur le gel sont ensuite transfrs sur une
membrane de nitrocellulose ou de Nylon puis dnaturs
(alternativement la dnaturation peut se faire avant le transfert).
4. Les diffrents fragments dADN sont ensuite fixs sur la
membrane (chaleur ou UV)
5. Comme on utilise une membrane, les amorces ou les sondes
peuvent avoir des liaisons non spcifiques et shybrident avec la
membrane, pour rsoudre ce problme on procde une
prhybridation (saturation de la membrane avec des ADN simple
brin htrologues pour lamorce)
La membrane est ensuite
plonge dans une solution
contenant un fragment
d'ADN marqu
radioactivement simple
brin (sonde).le bain est
maintenu une Tm ,

La membrane est lave une


temprature proche du Tm de faon
retirer les hybridations non
spcifiques
Technique de Southern-
Blot
Cette technique est utile pour :

Nombre de gnes, dans ce cas il faut que la sonde provienne dun


ADN gnomique.

Dtection de mutations:
Exemple
Dans le mutant 1, le site Hind III situ dans le
fragment Eco RI de 5 kb est mut et nest plus
coup par lenzyme.

Dans le mutant 2, une dltion de 1 kb peut tre


dtecte dans le fragment Hind IIIEcoRI de 3 kb.
2. Technique de Northern-
Blot
C'est exactement le mme principe que le Southern, mais avec de
l'ARN comme cible.
Les ARN messagers ont des tailles variables, on peut donc les
sparer sur gel.

On peut dduire le nombre de transcrits et taille d'un ARN


3. Puce ADN
Une puce ADN est une lamelle de verre sur laquelle on a fix des
brins dADN qui sont souvent des oligonuclotides. Les brins sont
arrangs de telle manire connatre la squence correspondant
chaque spot.
Le nombre de spots peut tre trs lev, jusqu 100 000 par lamelle
de la taille dune lamelle utilise conventionnellement en
microscopie
La sonde est marque laide dun compos fluorescent et la
dtection seffectue laide dun laser. La prsence dune
hybridation indique quil existe une squence complmentaire dans
la sonde.
Exemple: si on spotte toutes les squences des gnes connus
chez lhomme et quon hybride avec les ARN dun type
cellulaire, les gnes qui shybrident correspondent ceux qui
sont exprims dans les cellules ayant servi prparer la
sonde.

Exemple: On peut aussi spotter les gnes correspondant


une bactrie qui contamine les aliments. On prpare une
sonde laide dADN extrait de laliment, lorsquil y a
hybridation on en dduit que la bactrie est prsente dans
laliment.
4. Hybridation sur
colonie
* Des colonies sont tales sur une bote de ptri. Une fois
quelles ont pouss, on fait une rplique sur une membrane de
nitrocellulose.
* Les colonies sur la membrane de nitrocellulose sont lyses par
la soude, lADN est ainsi libr et dnatur. Il se fixe sur la
nitrocellulose lemplacement de la colonie.
* Aprs avoir satur la membrane avec de lADN neutre, qui est
diffrent de lADN prsent dans les colonies, on hybride la rplique
avec une sonde marque. Lhybridation aura lieu seulement sur les
squences complmentaires.

Lemplacement de lhybridation permettra de connatre la prsence


dune squence complmentaire de la sonde dans une des colonies
tales sur la bote. Cette mthode permet de cribler des banques de
plasmide.
CONCLUSION :
Cette technique permet de :
-mettre en vidence au sein dune cellule ou dun tissu
,une squence dacide nuclique par exemple de localiser
un locus sur un chromosome
-mettre en vidence la suppression des introns de
lARNm mature avec lADN duquel il a t transcrit ,
lADN fait des boucles qui mettent en vidence la
suppression des introns de lARNm mature durant
lpissage alternatif
-dtecter la prsence dun acide nuclique dune
squence donne par utilisation dune sonde
-savoir le squenage dun ADN a partir de lutilisation
dune sonde dont le squenage est connue