SEMINARIO N 2

APLICACIONES DIAGNSTICAS DE LAS

TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

22 DE MAYO DE 2013

Esteban Parra Gonzalo Yez

OBJETIVOS

Objetivo General:

o Conocer las principales tcnicas de Biologa Molecular

utilizadas en Microbiologa Clnica.

Objetivos Especficos:

o Conocer los fundamentos de las tcnicas de Biologa Molecular

utilizadas en Microbiologa Clnica

o Conocer las aplicaciones de las tcnicas de Biologa Molecular en

el diagnostico Microbiolgico.

o Conocer los Ventajas y Desventajas, costo/beneficio,

accesibilidad, laboratorios en Chile de las tcnicas de Biologa
Molecular en el diagnostico microbiolgico.
INTRODUCCIN
Diagnstico directo o indirecto?

Las tcnicas de Biologa Molecular o Genmicas sirven al diagnstico

directo de microorganismos ya que buscan reconocer o evidenciar
partculas presentes en las bacterias, como por ejemplo su material
Gentico (DNA Y RNA) o antgenos especficos.

Conceptos previos

o ADN: es un cido nucleico que contiene instrucciones genticas

usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos
conocidos y algunos virus. Es responsable de su transmisin
hereditaria.
o ARN: es un cido nucleico formado por una cadena de ribonucletidos.
Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y
en ciertos virus. En los organismos celulares desempea diversas
funciones.
o Antgeno: Partcula que forma parte del microorganismo que es
reconocido como extrao por el husped y es capaz de producir una
respuesta inmune.
o Hibridacin: es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de
DIFERENCIAS ENTRE CLULAS EUCARIONTES Y PROCARIONTE

CARACTERS EUCARIONTE PROCARIONTE

TICA
TAMAO Gran De pequeo
tamao, tamao,
complejo sencillo
CROMOSOM Mltiples nico
AS Cromosoma Cromosoma
s
TIPO DE Lineal, ADN Circular,
DNA doble doble hebra.
hebra.
PROTEINAS Histonas, y Libre de
ASOCIADAS no-histonas protenas
UBICACIN Ncleo En zona nuclear
Tcnicas a revisar

o Amplificacin del ADN ("DNA")

mediante reaccin de polimerasa en
cadena (PCR)

o Southern blot

o Northern blot

o Secuenciacin de ADN
PCR
Generalidades: El PCR constituye una tcnica de amplia aplicacin
en los estudios de genmica y consiste en la replicacin in vitro
de cantidades relativamente pequeas de secuencias de
ADN en millones de copias durante un breve periodo de tiempo.
ADN Polimerasa http://medmol.es/glosario/65/
PCR http://medmol.es/tecnicas/13/
RT - PCR http://medmol.es/tecnicas/34/
http://www.youtube.com/watch?
v=kvQWKcMdyS4
 PCR (tradicional)
Deteccin y amplificacin de ADN
Cebadores, ADN polimerasa, etc.
Resultados al final del desarrollo
de la tcnica
Gran sensibilidad
Aplicaciones:
o Diagnstico prenatal de
enfermedades hereditarias
o Identificacin de un individuo
(medicina legal) o averiguar su
parentesco con otros (examen
de paternidad)
o Deteccin temprana de
patgenos
o Deteccin de cepas resistentes
a antibiticos
PCR Tiempo Real
Deteccin, amplificacin y
cuantificacin
Emplea sondas marcadas con
fluorocromos
En tiempo real (en fase
exponencial)
Mayor sensibilidad que PCR
tradicional
Aplicaciones:
o Pesquisaje de estabilidad
gentica y bioseguridad,
deteccin de mutaciones.
o Seguimiento de la exposicin a
radiaciones.
o Cuantificacin de los perfiles de
citocinas en clulas inmunes o
tejidos inflamados
o Cuantificacin viral
o Control de la eficacia de
frmacos.
o Deteccin de agentes
 NOMBRE EXMEN VALOR EXMEN

PCR tiempo real para ADENOVIRUS $ 46.000

PCR tiempo real para VRS (Virus Respiratorio Sincicial) $ 46.000

PCR tiempo real para ENTEROVIRUS $ 60.000

PCR tiempo real para Varicella zoster virus $ 60.000

PCR Virus Herpes Humano tipo-8 $ 46.000

PCR tiempo real para Citomegalovirus CUANTITATIVA $ 60.000

PCR Virus Papiloma Humano (HPV) $70.000

PCR Clamydias Trachomatis $25.000

PCR Neisseria gonorrhoeae $25.000

PCR Clase Mollicutes (Mycoplasma y Ureaplasma) $12.000

INSTITUO DE CIENCIAS BIOMDICAS FACULTAD DE MEDICNIA

UNIVERSIDAD DE CHILE. 2008
Southern
Blot
Generalidades: Llamada tambin hibridacin Southern, es una
tcnica simple y fcil de realizar que detecta fragmentos de ADN
separados por tamao mediante electroforesis en gel de
agarosa. Suma la separacin electrofortica de ADN con su
transferencia a un soporte solido (nylon o Nitrocelulosa) para su
hibridacin.
Southern Blot

Extraccin DNA Digestin por enzima de Restriccin Separacin

electrofortica desnaturalizacin transferencia hibridacin
deteccin.
Northern
Blot
Generalidades: Tcnica de laboratorio que se utiliza para
identificar y localizar las secuencias de ARNm que son
complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
Esta tcnica permite detectar la presencia del ARNm en un
tejido en particular y la cual permite tambin determinar el
tamao de la trascripcin de ese ARN mensajero.
Northern Blot
Secuenciacin
del ADN
Secuenciacin del ADN
o La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas
bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los
nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. se uso para
determinar la secuencia nucletida completa del genoma humano.

o Sirve para tener una base de datos de la secuencia que tiene el

genoma de las diferencias especies bacterianas > Tipificacin de
microorganismos

o MLST: La Tipificacin multilocus de secuencias (en ingls Multilocus

sequence typing, MLST) es una tcnica gentica para la
caracterizacin taxonmica de bacterias y microorganismos.

o Base de datos : http://pubmlst.org http://www.mlst.net/

CONCLUSIN

Por qu usar tcnicas de biologa molecular en Microbiologa.

o Similar a las pruebas de una escena del crimen
o Las ventajas de estas tcnicas radican en su sensibilidad,
especificidad y su seguridad.
o Seguridad
o Sensibilidad:
o Especificidad:
o Resistencia a los antibiticos
o Rapidez

Desventajas:
o Probabilidad de Falsos positivos y falsos negativos por
contaminacin de la muestra.
o Costos elevados en comparacin con tcnicas tradicionales,
Gram o Cultivo.
REFERENCIAS

o Fernndez A., et al. Reaccin en cadena de polimerasa (PCR) para

detectar formas infectivas de Onchocerca volvulus en Simulium
meallicum s.l. (Dipteria: Simullidae) en reas endmicas de Venezuela,
2008.
o Garcs M., Taq polimerasa recombinante para aplicaciones de
diagnstico molecular, 2008
o Centros Mdicos Dr. Stamboulian. Tcnicas moleculares de
Microbiologa en la prctica diaria. Revista Bioanlisis. Disponible en
http://www.revistabioanalisis.com/arxius/notas/tecnicasmoleculares.pdf
o Ferrer A., et al. Una aproximacin a la genmica.
o Herskovic V., et al. El uso de tcnicas de biologa molecular en los
artculos publicados en la Revista Mdica de Chile. Revista Mdica de
Chile. Scielo, 2000.
o Luque J., Biologa molecular e Ingeniera gentica 1 Edicin, 2001
o Lodish, Biologa Celular y Molecular. 5 Edicin, pg. 377
o Murray P., Microbiologa Mdica

Links de inters
o Northern Blot. http://teachline.ls.huji.ac.il/72320/methods-
tutorial/northern.html
o Diagnstico Molecular.