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DIFERENTES METODOLOGAS PARA EL ESTUDIO DE LAS CLULAS

Debido al tamao de las clulas, la biologa celular y molecular son muy


dependientes del desarrollo de nuevos instrumentos y tecnologas ms que otras
reas de la biologa. Es muy importante conocer las diferentes tcnicas que son
usadas y ejemplos del tipo de informacin que dichas tcnicas nos proporcionan.

EL MTODO CIENTFICO

El mtodo cientfico es un procedimiento que se sigue para dar explicaciones y


generalizaciones a un fenmeno observado.

La secuencia y pasos del mtodo cientfico consisten en el planteamiento de


preguntas y la bsqueda de respuestas. Esas preguntas surgen por la informacin,
que pueden ser observaciones (primer paso), mediciones, conteos, y una
revisin de documentos histricos, se estudia cuidadosamente para encontrar sus
regularidades y relaciones.

Luego se formula una suposicin congruente llamada hiptesis (segundo paso),


con la que los datos quedan delimitados por un marco conceptual. Para el
planteamiento de esta hiptesis se recurre a la lgica inductiva. Esta ltima es un
proceso de razonamiento que empieza normalmente con fragmentos especficos (o
individuales) de informacin y de los cuales se deduce una premisa general (o
universal).

Una vez planteada una hiptesis, se pone a prueba efectuando experimentos


(tercer paso) y recopilando ms informacin con la que finalmente se apoya o
refuta esa hiptesis. Una vez obtenidos y analizados los resultados de los
experimentos se obtiene una conclusin (cuarto paso). Un buen experimento
tiene una muestra amplia; es controlado de tal manera que slo se estudia una
variable y se conduce de una manera ciega, es decir sin predisposicin a un
resultado.
LLas clulas pueden ser estudiadas de diferentes formas:
aa) Utilizando la clula ntegra.
bb) Permeabilizando la clula usando: Detergentes (digitonina); Estreptolisina O;
Electroporacin.
cc) Utilizando sistemas de microinyeccin.
CULTIVOS DE CLULAS
LLas clulas tienen la capacidad de crecer fuera del organismo.
Las ventajas de tener cultivos de clulas.
aa) La facilidad de obtener clulas en gran cantidad.
bb) Los cultivos contienen un tipo nico de clulas.
cc) La amplia variedad de los diferentes tipos de clulas que pueden crecer en
cultivo.
dd) El gran nmero de diferentes actividades celulares que se pueden estudiar
(endocitosis, movimiento celular, divisin de la clula).
ee) Estudio de la diferenciacin celular.
ff) Estudio de la respuesta celular a frmacos, hormonas, factores de
crecimiento.
Los tipos de cultivos son dos: primarios y secundarios.
LLos primarios son clulas que se obtienen a partir del propio organismo.
Pueden ser en masa (gran nmero de clulas) y clonal (nmero pequeo de
clulas en la caja de cultivo). Los secundarios son aquellos que provienen de un
primario. Clulas previamente cultivadas.

Caractersticas del crecimiento del cultivo de clulas:

Cultivo de clulas animales: Presentan mayor dificultad que los hongos y


bacterias para crecer, debido al requerimiento de medios ms complejos
(vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, etc.); Se obtienen casi siempre de
tejido embrionario y tumoral (por su rpido crecimiento); Se tratan con tripsina para
eliminar uniones entre las clulas. Las clulas de tejido normal tienen un nmero
limitado de divisiones celulares (50 100). De las clulas tumorales se obtienen las
lneas celulares inmortales. En general son clulas con ciclos celulares de 20 h
aprox.

Cultivo de clulas vegetales: Son totipotenciales (formacin de planta completa a


partir de un solo cultivo celular), son necesarios factores de crecimiento.

Los virus: Son organismos intracelulares constituidos por material gentico y una
cubierta protica. Por esto requieren una clula para reproducirse, ya que emplean la
maquinaria celular del husped. Tienen crecimiento rpido (20-30 min).
Microscopios pticos y electrnicos

Existen varias tcnicas para el estudio de la clula. Entre ellas la Microscopa


ocupa un lugar muy importante.
Microscopa es la ciencia que abarca todos los mtodos y aplicaciones que
emplean microscopios. Existen dos tipos de microscopa: luz y electrnica.
El microscopio es un instrumento ptico capaz de amplificar y resolver detalles
finos de un objeto tan pequeo o tan fino en estructura que no puede ser visto a
simple vista.
Un microscopio simple es aquel que est formado de una sola lente.
Un microscopio compuesto es aquel que est formado de dos ms lentes.
EEl microscopio est constituido bsicamente de tres sistemas:
1El ptico: lentes objetivos y oculares. El de iluminacin: lmpara, lente
colectora, condensador y diafragma iris. El mecnico: base, brazo, tornillo
macro y micromtrico, revlver, platina, pinzas sujetadoras y tubo del
microscopio.

La apertura numrica es un nmero que nos indica la capacidad de una lente


para captar la luz. Est expresada con la frmula:
A.N. = n sen n; ndice de refraccin del medio donde se observa.
; ngulo del semicono de luz formado entre espcimen y la
lente frontal del objetivo usado.

El poder de resolucin es la distancia ms pequea entre dos puntos los cuales


pueden ser vistos como separados. Tiene que ver con la calidad ptica con la cual
una lente permite discriminar los detalles finos de un espcimen. Se expresa con la
frmula
L.R. = 0.61 /n sen donde L.R. Es el lmite de resolucin y es la longitud
de onda de la luz empleada.

(Tomado de:
Molecular Biology
of the Cell. 3th.
Edition. B. Alberts,
D. Bray, J. Lewis,
M. Raff, K.
Roberts, J.D.
Watson. Garland
Publishing Inc.
1994. Pag.142)
El lmites de resolucin del ojo humano es de 0.1 mm, del microscopio
de luz 0.2 m y del microscopio electrnico, 0.4 nm.

(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th.


Edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.
Roberts, J.D. Watson. Garland Publishing Inc. 1994.
Pag. 140.)
La formacin de la imagen al microscopio de luz ocurre cuando los rayos de luz
provenientes inicialmente de la lmpara son recibidos por el condensador y enviados
al espcimen. Los rayos de luz que pasan la muestra son recibidos por la lente
objetivo, la cual forma una imagen real y amplificada del espcimen. Esta imagen es
tomada ahora por la lente ocular, formando una imagen virtual y ms amplificada.
Finalmente el ojo humano toma esta segunda imagen y forma una imagen real y
aumentada del espcimen en la retina, misma que es enviada a una zona del
cerebro por el nervio ptico.
Existen varias tcnicas de microscopa de luz entre ellas:

Campo claro. Es la ms comn, generalmente se observan preparaciones fijas o


teidas con algn colorante.

Campo oscuro. En este tipo de microscopa se obstruyen los haces centrales de


luz, iluminando solo la periferia de la preparacin. Se utiliza para observacin de
cilios y flagelos entre otros.

Contraste de fase. Cambia las diferencias de ndices de refraccin del espcimen


en diferencias de intensidad perceptibles al ojo humano. Lo hace con anillos de fase
que retrasan parte de la luz tanto en el condensador como en la lente objetivo.
Ideal para observar clulas vivas.

Dos formas de obtener


contraste en microscopa de
luz. (A) Las clulas teidas
reducen la amplitud de la
longitud de onda que pasa a
travs de ellas. (B) la luz en
fase que pasa a travs de
clulas vivas sin teir es
modificada y los cambios de
fase de la luz pueden ser
visibles en el microscopio de
contraste de fases.

Watson. Garland Publishi(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th.


Edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. ng Inc.
1994. Pag. 145).
Polarizacin. Aprovecha la propiedad ptica de birrefringencia que poseen ciertas
sustancias. Utiliza dos filtros polarizador y analizador para su observacin. Es
ideal para la observacin de cristales (sedimento urinario).

Fluorescencia. Tcnica microscpica que hace uso de fluorocromos, que en


contacto con la muestra se adhieren especficamente a alguna zona. Este
fluorocromo al ser iluminado con luz ultravioleta y con filtros adecuados, absorbe
la energa y luego la emite en el rango de la zona visible. Tcnica muy solicitada
para reacciones Ag-Ac y para detectar la presencia de macromolculas (ADN,
tubulina, enzimas, etc.)

Figura a la izquierda. Estructuras de dos colorantes fluorescentes


muy usados.
Figura superior. Sistema ptico del microscopio de fluorescencia.
(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th. Edition. B. Alberts, D.
Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Garland Publishing
Inc. 1994. Pag. 144.)
Sondas fluorescentes

Confocal. Esta tcnica moderna generalmente est asociada a fluorescencia. A la


muestra se le ilumina con rayo lser y se obtiene la imagen de un solo plano focal
eliminando los dems. Esta imagen es enviada a un monitor de computadora en
donde se puede reconstruir tridimensionalmente la imagen del espcimen
observado. As no hay necesidad de hacer cortes de las muestras que queremos
observar.
Esquema del mecanismo usado en el microscopio confocal. Puede Comparacin de una fotografa
enfocar en un solo plano del especimen. de microscopa de fluorescencia
tradicional y otra de microscopa
confocal.
(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th. Edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D.
Watson. Garland Publishing Inc. 1994. Pag. 147- 148.)

Microscopa electrnica

Tiene un lmite de resolucin de 0.4 nm lo que nos permite ver virus,


macromolculas, complejos enzimticos etc. que no es posible en el
microscopio de luz.

Existen dos tipos de microscopa electrnica: transmisin y barrido.

En la microcopa de transmisin se obtiene la estructura interna de las


clulas, es decir podemos ver su ncleo, mitocondria, etc. Para ello la muestra
es fijada con agentes qumicos como glutaraldehdo, postfijada con tetrxido de
osmio, deshidratada e includa en resina plstica y ya polimerizado el plstico,
se hacen cortes en un ultramicrotomo, se contrastan con sales de tomos
pesados y se observan.
Preparacin de un espcimen para su observacin en el microscopio
electrnico:
El tejido cortado se coloca en una solucin fijadora. Despus de lavado, se
deshidrata mediante el paso del tejido en soluciones de alcohol o acetona de
baja hasta alta concentracin. Despus se embebe en una resina que se deja
polimerizar en un horno para luego hacer cortes ultradelgados que se colocan en
una rejilla, se tien con soluciones de metales pesados y se observan al
microscopio electrnico.

Tomado de: Cell and Molecular Biology. 3th Edition. G. Karp, John Willey & Sons. 2002. Pag. 747.
Microfotografa electrnica de trasmisin de una clula de la punta de una raz teida con tetrxido
de osmio y otros metales pesados. (Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th. Edition. B.
Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Garland Publishing Inc. 1994. Pag. 151.)

La microscopa de barrido proporciona informacin de la estructura externa


de las clulas, permite observar para el procesamiento de las muestras su
superficie (como es por fuera). En este caso siguen los pasos anteriores pero
no hay necesidad de inclurla en resina plstica ni hacer cortes, sino que las
clulas completas se colocan en un soporte metlico, se cubren con una
pequea capa de oro (contrastante) y se observan.
Figura a la izquierda. Pasos para preparar una muestra para
microscopa electronica de barrido.
Figura superior. Microfotografa electrnica de membranas de
tilacoides de cloroplastos procesados por criofractura y microscopa
electronica de barrido. (Tomado de: Molecular Biology of the Cell.
3th. Edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D.
Watson. Garland Publishing Inc. 1994. Pag. 153-154.)

Los dos tipos de microscopios funcionan utilizando electrones en vez de luz.


Estos llegan a una columna que tiene vaco y pasan a travs de lentes
electromagnticas (en vez de lentes de vidrio) y chocan con la muestra. En la
microscopa de transmisin los electrones que atraviesan la muestra pasan a otra
lente que forma una imagen que luego es amplificada y proyectada en una
pantalla. En la microscopa de barrido los electrones que rebotan son recibidos
por un detector colocado cerca de la zona del espcimen y junto con otro haz
electrnico que recorre la cara de un tubo de rayos catdicos, forman una imagen
similar al de una pantalla de televisin.
(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th. Edition. B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.
Roberts, J.D. Watson. Garland Publishing Inc. 1994. Pag. 150.)

Citoqumica

La citoqumica consiste en la identificacin y localizacin de los diferentes


compuestos qumicos dentro de la clula. Lo anterior puede ser tanto cualitativo
como cuantitativo.

La citoqumica tiene dos mtodos principales de investigacin: microscpico y


bioqumico (microqumico, pequeas cantidades de material).

Citoqumica de cidos nucleicos, reaccin de Feulgen, hidrlisis cida dbil y


reactivo de Schiff. Extrae el ARN pero no el ADN. Identificacin y localizacin de
lpidos con Sudan IV. Diversas enzimas se detectan despus de la incubacin con
sustratos apropiados. Deteccin de cobre con neocuprona.
Inmunocitoqumica

Consiste en acoplar colorantes fluorescentes a molculas de anticuerpo para la


identificacin y localizacin de protenas en el interior de la clula. Acoplando un
anticuerpo a fluorescena y otro a rodamina (que son los dos colorantes
fluorescentes ms usados) se puede comparar la distribucin de diferentes
molculas en la misma clula.

Ejemplo 1. Si se quiere localizar protenas de citoesqueleto, se utiliza un anticuerpo


contra alguna protena de este organelo (p. ej. Anti-actina) que se pone en contacto
con la clula completa o un corte de ella (actina, antgeno). Este anticuerpo lleva
una molcula marcadora que es fluorescente y que la podemos ver a travs del
microscopio de luz (fluorescencia, confocal) y observar su localizacin.

Ejemplo 2. Si se quiere investigar la presencia y distribucin de una protena que


interviene en la organizacin del citoesqueleto de actina llamada Rho, se pone en
contacto la clula completa o un corte de ella (protena Rho, antgeno) con un
anticuerpo. Despus de un lavado, se pone en contacto con un segundo anticuerpo
(que se pega al primero) que lleva acoplado una partcula de oro coloidal, la cual
podemos ver por microscopa electrnica y as saber si est y donde est esa
protena Rho.

Figura a la izquierda. Estructuras de dos colorantes fluorescentes


muy usados.
Figura superior. Sistema ptico del microscopio de fluorescencia.
(Tomado de: Molecular Biology of the Cell. 3th. Edition. B. Alberts, D.
Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Garland Publishing
Inc. 1994. Pag. 144.)

Sondas fluorescentes
Los anticuerpos tambin pueden ser marcados con partculas densas a los
electrones, como lo son las esferas de oro coloidal. Estos anticuerpos
pueden ser usados en las clulas para localizar molculas especficas
mediante microscopa electrnica de trasmisin. En las microfotografas se
podrn observar los puntos correspondientes a las partculas de oro sobre
la superficie de las clulas observadas.

Esquema de los componentes


para la deteccin de
antgenos mediante
inmunocitoqumica y
microscopa electrnica de
trasmisin.
FFraccionamiento celular
Se rompen las clulas para obtener un homogenado del cual se pueden purificar
protenas utilizando:
aa) Un amortiguador de rompimiento a un pH determinado
bb) Temperatura: 4C.
cc) En presencia de inhibidores de proteasas: Leupeptina, antipana, E-64,
etc.

FForma de rompimiento
L- Lisis osmtica, mediante una solucin hipotnica. Se puede utilizar para
romper clulas eucariticas animales
2- Homogenizacin, mediante rompimiento mecnico (Poter). Se puede utilizar
para romper clulas eucariticas animales.
3- Vibracin ultrasnica. Se puede utilizar para romper clulas eucariticas
animales.
4- Rompimiento balstico, usando perlas de vidrio. Se utiliza para romper clulas
con pared como bacterias y esporas.
- Usando enzimas lticas del tipo de la lisozima. Se utiliza para romper
enzimticamente la pared celular de bacterias o esporas. Despus se puede
utilizar un mtodo de los tres primeros.

Centrifugacin

El homogenado obtenido en el fraccionamiento celular, se puede someter a un


proceso de centrifugacin a diferentes velocidades (centrifugacin diferencial)
para obtener diferentes fracciones (macromolculas, organelos y clulas) celulares
las cuales provienen de una mezcla de partculas que difieren en masa o densidad.

Velocidad Pastilla obtenida


1,000 x g, 10 min. Clulas completas, ncleos, citoesqueleto
20,000 x g, 20 min. Mitocondrias, lisosomas, peroxisomas
80,000 x g, 1 h. Microsomas, vesculas pequeas.
150,000 x g, 3 h. Ribosomas, virus, macromolculas.
Otro mtodo de separacin por centrifugacin es la centrifugacin en gradiente la cual separa
partculas o molculas independientemente de su tamao y forma. Se utiliza sacarosa a diferentes
concentraciones (20 60%).
a) Centrifugacin diferencial. B) Centrifugacin en gradiente.
Electroforesis

En general la electroforesis se define como la migracin de iones en un campo


elctrico. Una molcula cargada positivamente migrar hacia el electrodo negativo o
ctodo y aquellas cargadas negativamente migrarn hacia el nodo o electrodo
positivo.

HHay dos tipos de electroforesis:

- - Electroforesis en papel. Esta consiste en la separacin de molculas


pequeas cargadas (aminocidos o pptidos pequeos). El material que se
utiliza es papel filtro o acetato de celulosa.

-- Electroforesis en gel. Se utiliza para separar protenas y cidos nucleicos.


Las separaciones moleculares se basan en la filtracin a travs de un gel y en
las movilidades de las molculas a separar. Tipos: Nativa (en ausencia de
detergente inico) y desnaturalizante (en presencia de detergente inico). Esta
ltima puede ser realizada en condiciones reductoras (en presencia de 2-
mercaptoetanol) o no reductoras (en ausencia de 2-mercaptoetanol).
Separacin de dos polipptidos o subunidades unidas por puentes
difulfuro.

-S-S-

Protenas calentadas con SDS y 2-mercaptoetanol.

C
A + B

Protenas cargadas negativamente

C
B

A
AAutorradiografa

SSi a una clula se le proporciona un precursor de alguna macromolcula que


sea radiactivo, al obtener los homogenados y procesar o separar las
macromoleculas, estas se encontrarn radiactivas. Al separar estas molculas
mediante electroforesis quedan inmviles en el gel y al exponer este gel a una
pelcula fotogrfica, producir una imagen de s mismo. Este procedimiento
puede realizarse en mezclas de macromolculas separadas en:
- Papel. Transferencia de bacterias.
- Agarosa. Hibridaciones de DNA o RNA.
- Poliacrilamida. Electroforesis de protenas.

Los radioistopos comunes usados en


Biologa:
Istopo Vida media
32
P 14 das
131
I 8.1 das
35
S 87 das
14
C 5570 aos
45
Ca 164 das
3
H 12.3 aos

Emisiones
AgBr Ago