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Les mthodes sparatives:

la chromatographie
I- Introduction
II- Chromatographie sur colonne : aspects gnraux
III- La chromatographie liquide haute performance (HPLC)
III- La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
IV- La chromatographie dexclusion strique (SEC)
V- Analyse quantitative

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I- Introduction
1- Historique
En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT (1872-1919)
purifie des pigments vgtaux, comme la chlorophylle, sur une colonne
de craie. Il donne alors ce phnomne de sparation le nom de
chromatographie (du grec khrma, couleur et graphein, crire) quil dfinit
comme lenregistrement graphique des couleurs. On assiste alors la naissance
de la chromatographie.

En 1952, les biochimistes A. J. P Martin et R. L. M. Synge


reoivent le prix Nobel de chimie pour leur contribution au
dveloppement de la chromatographie moderne.

La chromatographie connu un essor important durant ces 50 dernires annes dont lorigine tient, dans
une large mesure, au fait que se trouvent associs une mthode sparative rapide et performante
couple des dtecteurs sensibles et varis.
Aujourdhui
chromatographie prparative
chromatographie analytique

2
2- Dfinition : IUAPC
(International Union of Pure and Applied Chemistry)
La chromatographie est un procd physico-chimique de sparation dun
mlange homogne liquide ou gazeux. Le principe repose sur l'quilibre
de concentrations des composs prsents entre deux phases en contact : la
phase stationnaire et la phase mobile qui se dplace. La sparation est
base sur l'entranement diffrentiel des constituants du mlange.

La phase stationnaire est une phase qui reste en


place, soit dans une colonne, soit sur une surface
plane.
La phase mobile est une phase qui se dplace sur
ou travers la phase stationnaire, entranant
lanalyte avec elle.
L'lution est un processus au cours duquel les
analytes sont entrans travers une phase
stationnaire par le mouvement dune phase mobile. 3
3- Classification
Selon la technologie mise en uvre
Chromatographie sur colonne
Chromatographie de surface :sur papier ou sur couche mince (CCM)

Selon la nature des phases


Selon la nature de la phase mobile on distingue:
la chromatographie en phase liquide CPL
la chromatographie en phase gazeuse CPG
la chromatographie en phase supercritique CPS
Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:
la chromatographie gaz / solide CGS
la chromatographie gaz / liquide CGL
la chromatographie liquide / solide CLS
la chromatographie liquide / liquide CLL

Selon la nature des phases phnomnes mis en jeu dans la sparation


La chromatographie dadsorption base sur les processus rpts dadsorption/dsorption par la
phase stationnaire (solide)
La chromatographie de partage base sur les diffrences de solubilit des molcules entre la phase
stationnaire (liquide) et la phase mobile
La chromatographie dchange dions change entre une phase stationnaire ionise et un solut
ionis ou ionisable
La chromatographie dexclusion base sur la sparation des molcules en fonction de leur taille
La chromatographie daffinit Il sagit l dune association entre une molcule polyfonctionnelle et
une phase stationnaire comportant des sites striquement dfinis et de capacit dchange multiple
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4- Les interactions
Le partage des analytes est donc guid par leurs interactions avec chacune des deux phases.
Plus l'analyte interagit avec la phase stationnaire, plus son lution sera longue.

Forces de Toutes les molcules


dispersions
induit/induit
Interactions Molcules polaires
0,5
diple/diple Alcools
10 Ethers
permanent/permane kJ.mol-1 Amides
nt permanent/induit Amines
Nitriles
Molcules possdant des
Liaisons 8 e -

Molcules possdant
hydrogne 40 des H labiles
kJ.mol-1
Interactions 40 Ions
dilectriques 85
kJ.mol-1
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II- Chromatographie sur colonne:
aspects gnraux
Le processus chromatographique
Le chromatogramme et les pics chromatographiques
Les grandeurs fondamentales de la chromatographie
La relation fondamentale

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1- Le processus chromatographique
La phase mobile est continuellement introduite sur la colonne
Lchantillon est introduit sans arrter le flux de phase mobile
Les soluts se rpartissent entre les deux phases
Les composs sont lus en fonction de leur affinit vis--vis des phases
Les soluts sont dtects en sortie de colonne par le dtecteur

CA stationnaire
KA
CA mobile

(KA1)
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2- Le chromatogramme et les pics chromatographiques
Le rsultat de lanalyse est le chromatogramme (ensemble de pics)
Le pic chromatographique reprsente la distribution statistique des temps
de transit du compos dans la colonne : cest une courbe de Gauss
(en chromatographie idale )
Moyenne : temps de rtention
Variance : lie l talement de l arrive des molcules

Le temps de rtention est une


grandeur qualitative :il est
identique pour des conditions
identiques
Laire ou la hauteur est une
grandeur quantitative

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W : largeur du pic une ordonne
dtermine

W2 a 2

A la
base

W 4 1,7

A la mi-
hauteur

W 5,54 2,36 0,59


Isothermes de distribution :

A: situation idale pic gaussien


B : situation dans laquelle la phase stationnaire est sature
C : situation inverse dans laquelle le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire

Facteur de trane : Ft = b/a


A : Ft = 1 ; B : Ft > 1 ; C : Ft < 1
3- Les grandeurs de rtention
Temps de rtention:
rtention
Le temps de rtention tR: temps coul entre linstant de linjection et celui dtermin au
maximum du pic
Le temps mort tm (ou t0) : temps de rtention dun compos non retenu par la colonne
Le temps de rtention rduit tR: diffrence entre temps de rtention et temps mort

tR = tR -
tm
tR
Expression du temps mort: Longueur

t m t R
L L
tM Dbit
u D
Vitesse .s
linaire

Section
temps Porosit

Top dinjection Pic de lair Pic de solut

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Volumes de rtention:
o Le volume de rtention VR : volume de phase mobile ncessaire
llution du compos : VR = tR x D
o Le volume mort Vm : volume de phase mobile ncessaire
llution dun compos non retenu par la colonne
= volume de phase mobile dans la colonne = volume interstitiel
accessible = VM
VM = V0 = tm x D = t0 x D
o Le volume de rtention rduit : diffrence entre volume de
rtention et volume mort VR = VR VM

oOn dmontre que : VR = VM + K VS


Le temps de rtention dpend
avec V S =
Du couple solut-phase volume de
stationnaire phase stationnaire
en CPG
Du triplet solut-phase stationnaire-phase mobile en CL
Du dbit de la phase mobile

De la masse de phase stationnaire dans la colonne

De la temprature de la colonne

De la longueur de la colonne

Le temps de rtention ne dpend pas


De la quantit de solut inject

De la nature et de labondance des autres constituants

De la nature de la phase mobile en CPG


4- Les grandeurs de rtention relatives
Facteur de rtention ou facteur de capacit k
Il dcrit la vitesse de progression dun solut dans la colonne
une valeur de k leve indique que le compos est fortement retenu par la colonne et quil
passe un temps significatif interagir avec la phase stationnaire
Les chromatographistes essaient davoir des valeurs de k comprises entre 1 et 10

[solut dans Volume de


phase phase
stationnaire] stationnaire

mS CS VS VS VR' t R'
k K
mM CM VM VM Vm t m

[solut dans Volume de


k est indpendant phase mobile] phase mobile
De faibles variations de
dbit
Des dimensions de la
t R t0 1 k t m (1 k) VR V0 1 k Vm (1 k)

colonne

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Exercice dapplication :
Exprimer le temps danalyse , assimilable au temps de rtention du compos le plus retenu en
fonction de la longueur de colonne L , de la vitesse de la phase mobile u et des volumes de phase
mobile VM et de phase stationnaire VS dans la colonne

VS
tR t0 1 k tm (1 k) avec k K
VM

L
tm
u
donc

L VS
tR ( )(1 K
u VM
5- Lefficacit : Nombre dtages thoriques N
Le nombre dtages thoriques mesure la
dispersion de lanalyse lors de sa traverse de la
colonne
Les quilibres sur la colonne - Analogie avec une
colonne
64 mg de distille
A
5
K=1 quilibres
11 22 33 44 55

11 S
S 32
32 16
16 88 44 22
M
M 32
32 16
16 88 44 22

22 S
S 00 16
16 (8+8)=16
(8+8)=16 (8+4)=12
(8+4)=12 (6+2)=8
(6+2)=8
M
M 00 16
16 (8+8)=16
(8+8)=16 (8+4)=12
(8+4)=12 (6+2)=8
(6+2)=8

33 S
S 00 00 88 (4+8)=12
(4+8)=12 (6+6)=12
(6+6)=12
M
M 00 00 88 (4+8)=12
(4+8)=12 (6+6)=12
(6+6)=12
5
44 S
S 00 00 00 44 (2+6)=8
(2+6)=8
Plateaux M
M 00 00 00 44 (2+6)=8
(2+6)=8
55 S
S 00 00 00 00 22
M
M 00 00 00 00 22

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2 2
L t
N
R
L

2 2 2
tR tR tR
N 16 5,54

N dpend
De la nature de la colonne (capillaire
ou remplie)
De la qualit de la prparation de
cette colonne
De la faon dont elle est employe

La hauteur quivalente un plateau L


thorique (HEPT) HEPT
L = longueur de la colonne N
La thorie des plateaux nglige le passage continue de la phase mobile sur la phase stationnaire
Ce passage produit un largissement ou un rtrcissement des pics
Giddings lie la HEPT des paramtres qui dpendent de la vitesse de la phase mobile

Equation de Van Deemter B


H HEPT A Cu
u
A = diffusion turbulente due lcoulement irrgulier de la phase mobile
travers la phase stationnaire (particules plus ou moins rgulires)
indpendant du dbit
ne dpend que des particules ( quand le diamtre )

B = diffusion longitudinale, rend compte de la diffusion des molcules dans la direction


de lcoulement
B 2 Dm
dautant plus important que la vitesse est faible
Dm coefficient de diffusion dans la phase mobile ;
tortuosit
C = transfert de masse reprsente les ingalits de passage des molcules dune phase
lautre
Toutes les molcules ne sont pas entranes la mme vitesse
Le contact entre phase mobile et phase stationnaire ne seffectue pas partout de
manire identique
u = vitesse de la phase
Le molcules mobile dans
de soluts , dpend de : stationnaire sont situes des distance
la phase
La temprature
variables de la phase mobile
La pression
La colonne
B
uopt
C
6- Le facteur de slectivit :
Dcrit la position de 2 pics adjacents situs sur un chromatogramme. Il est toujours suprieur 1.
reprsente la capacit qu une colonne sparer chimiquement deux composs

0 CS
quilibre CS CM G RT ln K RT ln
CM

G G20 G10 RT ln
'
t R2
'
t R1
' '
t R2 t R1 >1

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7- Le facteur de rsolution Rs
Donne la mesure quantitative de laptitude dune colonne sparer
deux soluts

RS 2
tR2 tR1
2
t'R2 t'R1
2 1 2 1
:largeur du pic la
base

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Exercice dapplication :
Exprimer Rs en fonction des largeurs des pics mi-hauteur

RS 2
tR2 tR1
avec 1,7
2 1

donc RS 2
tR2 tR1
1,18
(tR2 tR1 )
1,7 2 1,7 1 ( 1 2 )

(tR2 tR1 )
RS 1,18
( 1 2 )
8- Relation fondamentale
1 1 k'2
Relation de PURNELL R x N2 x x
4 1 k'2

Terme Terme
cintique thermodynami
que
Relation
dapproximation 1 1 k'
R x Nx x
2 1 1 k'

k1 k 2
k
2
N1 N 2
N
2

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Exercice dapplication :
A ) Montrer que lexpression de Purnell est quivalente celle de la dfinition chromatographique de Rs
lorsque les 2 pics ont des largeurs gales (1 = 2 )

RS 2
tR2 tR1
2
tR2 tR1 tR2 tR1
car 1 2
2 1 22 2

t
2
4tR2
or N2 16 R2 2
2 N2

tR2 tR1 tR2 tR1 N2 1 tR2 tR1


RS N2
2 4tR2 4 tR2

or tR tm (1 k)
k1
k2 (1
RS
1 t (1 k2 ) tm (1 k1 ) 1 N k2 k1 1 N
N2 m
k2
2 2
4 tm (1 k2 ) 4 (1 k2 ) 4 (1 k2 )
k2
et
k1 1
k2 (1
k
1 1 k2 1 1 2 ( 1)
RS N2 N2 1 N
4 (1 k2 ) 4 (1 k2 ) 4 2 (1 k )
2
B ) Montrer que la relation dapproximation est quivalente celle de la dfinition chromatographique
de Rs lorsque les 2 pics ont des efficacits gales (N1 = N2 )
2 2

RS 2
tR2 tR1 or N 16
tR2
16
tR1
car N1 N2
2 1
2 1

2
4tR2
et 1
4tR1 N tR2 tR1
RS 2
N N 4 tR2 tR1

avec tR tm (1 k)

RS
1 t (1 k2 ) tm (1 k1 ) 1 N k2 k1
N m
2 (tm (1 k2 ) tm (1 k1 ) 2 k2 k1 2

on pose k
k2 k1
2k k1 k2
2

1 (2k k1 ) k1 1 (2k 2k1 ) 1 (k k1 )


RS N N N
2 (2k k1 ) k1 2 2 (2k 2) 2 (k 1)
1 (k k1 ) 1 k k 1 k 2k1
RS N N (1 1 ) N (1 )
2 (k 1) 2 (k 1) k 2 (k 1) (k1 k2 )

1 k (k1 k2 ) 2k1 1 k (k2 k1 )


RS N ( ) N
2 (k 1) (k1 k2 ) 2 (k 1) (k1 k2 )
k2 k2
or k1
k1
k2 1
(k2
) (1 )
1 k 1 k
RS N N
2 (k 1) ( k2 k ) 2 (k 1) ( 1 1)
2

On multiplie par ( ) le numrateur et le dnominateur

1
) (1
1 k 1 k ( 1)
RS N N
2 1
(k 1) ( 1) 2 (k 1) ( 1)