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OBTENCIN Y PURIFICACIN DE

IgY DIRIGIDAS CONTRA LA


LECTINA DE SALVIA BOGOTENSIS
Paola Barroso, Hansen Murcia, Nohora Vega, Gerardo Prez
Laboratorio de Bioqumica, Departamento de Qumica,
Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C., Colombia.
OBJETIVO
Dado el inters que presenta el
antgeno Tn como marcador tumoral
en muchos tipos de cncer, y la
capacidad que tiene la lectina aislada
de semillas de Salvia bogotensis para
reconocer especficamente este
antgeno, se adelant el presente
trabajo con la meta de disponer de IgY
anti-lectina para emplearla en estudios
inmunohistoqumicos y de biologa
celular.
VENTAJAS DE LAS INMUNOGLOBULINAS PRESENTES
EN LA YEMA DE HUEVO DE GALLINA (IgY)

No interactan con factores


reumatoides.
No se unen a la proteina A
estafiloccica, ni a la proteina G.
La cantidad de IgY producida por
gallinas en su periodo de postura
es considerablemente alta (150-
225 mg/yema).
DESVENTAJAS
1

El contenido de lpidos en la yema 3


del huevo es del 50% entre los que
destacan colesterol (1),
Fosfolpidos (2) y fosfolipoproteinas
(3).
El papel de las lectinas
Las lectinas son protenas que se
unen a carbohidratos con gran
especificidad.
Entre estos carbohidratos estn
los antgenos T y Tn.
Los antgenos T y Tn tambin se
han encontrado asociados a
carcinomas, expuestos en la
membrana externa de clulas
tumorales comunes y en
Materiales y mtodos

Salvia Bogotensis
Organizaci
Se organizaron cuatro grupos de tres animales cada uno, de los cuales el n
primero correspondi al grupo control.
1 ml de emulsin se aplic en dos sitios distintos del msculo pectoral de Inmunizaci
n
gallinas de raza High-Line en edad de postura (20 semanas) mantenidas en
jaulas individuales con agua y alimento ad Libitum.
Preparaci
A 1mL de adyuvante de Freund se le agreg gota a gota 1 ml de estas n de la
emulsin
soluciones con agitacin vigorosa para obtener buena emulsificacin.
Lectina de
S.
Se prepararon soluciones de 100, 400, y 1000 g/ml en PBS (Fostatos 20mM, Bogotensis
NaCl 150 mM) a Ph 7,2.
Inmunizacin
Esquema de inmunizacin
Dosis de LSB en Das en los que Dosis Total en
g/ml se realiz la g/ml
inoculacin.
50 0, 10, 20, 29 200
200 0, 10, 20, 29 800
500 0, 20 1000

Los huevos se recogieron desde el da 9 hasta el da 9


cada huevo se marc con el nmero de la gallina
correspondiente y la fecha de recoleccin. Los huevos
almacenaron a 4C hasta su procesamiento.
REMOCIN DE LPIDOS Y EXTRACIN DE
IgY POR EL MTODO DE AKITA Y NAKAI

El volumen final
Se escogieron
obtenido fue de 43
yemas de huevos
ml con una
correspondientes a
concentracin de
las dosis de 200 g
(1,28 mg/ml de
en la inmunizacin.
proteina)

Se utiliz la
Se utilizaron 8
metodologa de
yemas (13ml/yema)
extraccin con agua
y se llevaron a un
destilada
volumen final de
acidificada y se
1040 ml con 936 ml
precipit con
de agua destilada.
sulfato de amonio.
Se utiliz el mtodo
Se obtuvo un
de extraccin que
volumen de 40 ml
no requiere
con una
acidificacin del
concentracin de
agua y
0,9mg/ml de
precipitacin con
proteina.
sulfato de sodio.
Otras metodologas
estudiadas.
Se ensayaron los mtodos de
Polson et al. y Jensenius y Koch
(22), que utilizan dilucin con
buffer y precipitacin con PEG
8000 al 3,5% o 4,4%,
respectivamente;
El mtodo de Jensenius et al.
precipitando con sulfato de
dextrano y CaCl2;
DETERMINACIN DE PROTEINA
POR EL MTODO DE BRADFORD

La curva de calibracin Tanto las muestras


se hizo por duplicado como el patrn de BSA
Los ensayos se con volumenes de 2,5 ; se llevaron a un
realizaron en placas de 10; 15 y 20 L de volumen de 20 l con
96 pozos solucin utilizando BSA PBS Ph 7,3 y se
de concentraciones de agregaron 200 L del
0,5 y 0,7 mg/ml. reactivo de bradford.

A partir de la curva de
Se incub durante 15 Se ley a 595 nm en un calibracin se
minutos a temperatura lector de microplaca determin la cantidad
ambiente. BioRad Model 550. de protena por
interpolacin.
Cuantificacin de la IgY purificada por el
mtodo del cido bicinconnico BCA.

A cada pozo se agreg


Se construy una 100 l de buffer
curva de calibracin carbonato ph 11,4
igual a la utilizada en (carbonato de sodio
el mtodo de Bradford. 0.25 M / Bicarbonato
de sodio 0.1 M)

A cada pozo se agreg Se agregaron 100 l de


20 l de la solucin a cido bicinconnico.
cuantificar.

Se dej incubar
durante 30 minutos a
37C y se ley a 540
nm.
Ensayo ELISA

Se incub con tampn


Se inmunizaron las de Se bloque con
placas con las
inmunoglobulinas carbonatos 0,1 M pH PBS-BSA (1,3%)
deslipidadas. 9,6 3 horas a 37C y durante 1 hora a 37C
durante la noche a 4C

Se sembraron 100 ml Se revel con 100 ml


de LSB (77 mg/ml) de anti-IgG marcado
Se ley la absorbancia
incubando durante 1 con peroxidasa e
a 405 nm en un lector
hora a 37C y, luego, incubando con cido
de microplaca BioRad
100 ml de IgG-anti- LSB 2,2 azino-bis (3-
Model 550
(generado en conejo) etilbenzotiazoline)-6-
durante 1 hora a 37C. sulfnico (ABTS).

Entre cada paso se hicieron tres lavados con PBS-Tween 20 al 0,1%.


Actividad de las fracciones
obtenidas en remocin de lpidos
evaluada por ELISA

Se utiliz como segundo


Las placas se
Cada fraccin se diluy anticuerpo anti-IgY
sensibilizaron con LSB
con Agua a ph 5 y 6,2 generado en cabra y
(30g/ml)
acoplado a peroxidasa.

El ttulo de los diferentes


pasos de extraccin de
Este segundo anticuerpo IgY se evalu haciendo
estaba preparado en una diluciones seriadas a
dilucin de 1/1000 en partir de una solucin de
PBS-SFB (10%) (Suero 500 mg/ml para un
fetal bobino) volumen final de 100 ml
por pozo en cada
dilucin.
Purificacin de IgY por
cromatografa.
DEAE- Sephacel

Fenil-sefarosa-4B

Sephacryl S-200

Sephacryil S-500
Cromatografa
tioflica
DEAE-Sephacel
Se sembraron 9ml Se equilibr con
del extracto sin tampn fosfatos
acidificar (8,2 mg) 70mM ph 6,3

La fraccin no La fraccin
retenida se eluy retenida se eluy
con tampn de con tampn fosfato
equilibrio ph 6,3-NaCl 1M

La fraccin
retenida y no
retenida se
dializaron contra
bicarbonato de
amonio 20mM y
se congelaron
Fenil sefarosa 4B

Se sembr
Se tomaron
sobre una
4ml (3,6 mg) Se equilibr
columna de
del extracto con NaCl 1%
fenil sefarosa
sin acidificar
4B (1X 50 CM)

Se lav la
La fraccin La fraccin no
columna con
retenida se retenida se
50 ml de
eluy con agua eluy con NaCl
acetonitrilo al
desionizada al 1%
70% (v/v)
Sephacril S-200

Sobre una
columna de
sephacril S-200 se
Se eluy con NaCl
sembraron 3ml
al 1%
(2,7mg) de
extracto sin
acidificar.
Sephacril S-500

Sobre una
columna de
sephacril S-200 se
Se eluy con NaCl
sembraron 1ml
al 1%
(0,9mg) de
extracto sin
acidificar.
Cromatografa tioflica
Se adicionaron 400 l
Se utiliz un soporte de Se elimin el carbonato
de B-MESH al 99% y se
sefarosa 4B activado de sodio en un embudo
dej en agitacin
con divinil sulfona y se resuspendi en 2ml
permanente durante 18
(DVS). de esta misma solucin.
horas.

Para el acople del


ligando B-MESH, se Se elimin la solucin y
Este fue acomplado con tom el gel activado y se lav el gel con
-Mercaptoetanol. se lav en un embudo abundante agua y NaCl
con 20ml de carbonato 1M.
de sodio 0,5M ph 11,0.

Se colocaron 2ml de Posteriormente el


sefarosa 4B lavados con doporte T-gel se
Se lav con abundante
20ml de agua destilada equilibr con tampn
agua destilada hasta
sobre un embudo con de fosfatos 50mM ph
que el pH del lavado
placa sinterizada y se 7,3 y sulfato de sodio
fuese neutro.
elimin el exceso de 0,5M
agua.

Se sembraron 3 ml
El gel fue resuspendido Se agregaron 200l (2,7mg) de extracto sin
en 4ml de carbonato de gota a gota en acidificar y se
sodio 0,5 M y ph 11,0 y constante agitacin agregaron 71 mg de
se dej en agitacin durante 15 minutos y sulfato de sodio por
suave. se dej ocho horas. mililitro de extracto.
Finalmente
La elucin del no
retenido se realiz
con tampn de
equilibrio y la del
retenido con buffer
fosfatos 50mM ph 7,3.

Las fracciones
provenientes de las
diferentes
cromatografas se
recolectaron y
algunas se
concentraron en
Microsep Omega de
10 kd a 7000 rpm.

Las fracciones de
anticuerpo puro se
cuantificaron por BCA.
Electroforesis en poliacrilamida
(PAGE-SDS)

En cada pozo se
sembraron 20g de Como tampn de
proteina ms 5 l Se utilizaron geles corrido se utiliz
de tampn de al 12% y 8% tris 25mM-Glicina
muestra con 192mM ph 8,8
reductor (B-MESH)

Luego del corrido


los geles se fijaron La electroforesis se
y colorearon con corri a 150V
solucin de durante 90
Coomassie R-250 minutos.
durante 3 horas.
Dot blot directo
En una microplaca (10
Se sembraron 5L por
l) se realizaron
punto sobre la Se incub durante 1 hora
diluciones de cada una
membrana de a temperatura ambiente.
de las fracciones en PBS-
nitrocelulosa.
SFB (10%).

Se revel con una


Se bloque agregando Se adicion una dilucin solucin de 50 mg de
20 ml de PBS-SFB (10%) 1/1000 de IgG anti-IgY diaminobenzamidina
y se dej en agitacin (DAB) en 100 ml de PBS
durante una hora a (cabra) acoplado a y 10 ml de H2O2 al 30%;
temperatura ambiente. peroxidasa. la reaccin se detuvo con
agua desionizada.

Entre cada paso se


hicieron tres lavados
agregando 20 ml de PBS- Entre el segundo y el
Tween (0,1%), a tercer paso no se realiz
excepcin del ltimo en el lavado.
el cual se lav cinco
veces.
Determinacin de la
funcionalidad de las IgY.

Sobre membranas de
Se incubaron las
nitrocelulosa se
Se bloque agregando membranas con
colocaron 5 ml de
20 ml de PBS-SFB diluciones de las IgY en
lectina pura (0,608
(10%) durante una hora PBS-SFB (10%) durante
mg/ml) en PBS por
a temperatura una hora a temperatura
punto durante una hora
ambiente. ambiente y 12 horas a
a temperatura
4oC.
ambiente.

Se incub con una


dilucin de 1/1000 de
IgG anti-IgY-peroxidasa Se revel y lav
en PBS-SFB (10%), siguiendo el
dejando en agitacin procedimiento anterior.
durante una hora a
temperatura ambiente.
RESULTADOS
Ensayos de inmunizacin.

Ensayos de deslipidizacin y extraccin.

Ensayos de purificacin de IgY.


Ensayos de inmunizacin

Produccin de IgY durante el periodo de la


inmunizacin con diferentes dosis de lectina
de salvia bogotensis.
Anlisis por PAGE-SDS
Anlisis por PAGE-SDS
Anlisis por PAGE-SDS de (A) fracciones deslipidadas y extradas
con agua a pH 6,2. Carriles 1: patrones de peso molecular; 2:
extracto pH 6,2; 3: deslipidado; 4: precipitacin con Na2SO4 19%.
(B) fracciones deslipidadas y extradas con agua a pH 5,0. Carriles
1: patrones de peso molecular; 2: extracto pH 5,0; 3: deslipidado; 4:
precipitacin con (NH4)2SO4 60% s. Las flechas indican la posicin
de las cadenas H y L.
Cuantificacin de protena de las fracciones
provenientes de los ensayos de deslipidacin.
Ensayos de purificacin de
IgY
Cuantificacin de proteinas en las fracciones
provenientes de las cromatografas.
Electroforesis PAGE-SDS para los extractos
obtenidos de las cromatografas.
Resultados de la cromatografa
tioflica.
Resultados Dot blot y PAGE-SDS
Conclusiones
La respuesta inmune obtenida con la lectina de S. bogotensis,
adems de mostrar la correlacin esperada entre dosis de
antgeno aplicada y cantidad de inmunoglobulina producida,
present una persistencia superior a 70 das, lo cual implica una
cantidad considerable de material disponible para aislar las IgY.
Entre los mtodos de deslipidacin y extraccin de IgY, la
precipitacin con PEG 8000 permite una buena recuperacin de
IgY con pocos contaminantes; sin embargo, su remocin,
necesaria para los anlisis posteriores, es difcil.
La deslipidacin por dilucin con agua sin acidificar es un
mtodo sencillo y rpido (extracto final en 2 a 3 das), con el cual
se puede procesar un volumen apreciable de yemas, lo que
permite la extraccin de gran cantidad de anticuerpos en
condiciones que no afectan la actividad de las IgY. El gran
inconveniente que presenta es la remocin incompleta de los
lpidos de la yema, que pueden interferir en ensayos como la
cuantificacin de protena.
Los resultados muestran el mtodo con agua acidificada es
el mejor procedimiento de delipidacin y extraccin pues,
adems de ser sencillo, preserv muy bien la actividad de
las IgY, se obtuvieron las mejores recuperaciones de
protena, se eliminaron los contaminantes de alto PM y el
nmero de protenas contaminantes de bajo PM no fue
muy elevado.
El conjunto de resultados obtenidos con los ensayos de
purificacin mostraron que la cromatografa tioflica de la
muestra acidificada es el mejor mtodo, ya que permiti
obtener IgY prcticamente puras con muy buenos
rendimientos usando un proceso sencillo y muy
reproducible, con el cual se preserv la actividad de los
anticuerpos.
Los anticuerpos as obtenidos y purificados han
demostrado ser una herramienta muy til en estudios de
reconocimiento del antgeno Tn en lneas celulares
tumorales por parte de la lectina de S. bogotensis, y sern
utilizados en estudios inmunohistoqumicos y de
interacciones con clulas mediadas por la lectina.