Trabajo Prctico N4

Aislamiento de Microorganismos

Diversidad Metablica
 Objetivo del Trabajo Prctico

Aislamiento de microorganismos partir de

distintos inculos (agua, ricota, arroz, tierra
y yogurt)

1)Enriquecimiento-Seleccin
2)Seleccin-Diferenciacin
3)Obtencin de un cultivo puro (Tincin de
Gram y Pruebas Bioqumicas)
 Microorganismos a aislar:

Enterobacterias (agua)
Pseudomonas spp. (agua)
Staphylococcus spp. (ricota)
Bacillus spp. (arroz)
Lactobacillus spp. (yogurt)
Azotobacter spp. (tierra)
 Medios de Cultivo: caractersticas generales

Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgnicas,

vitaminas)

Disponibilidad de oxgeno

pH

Humedad

Temperatura

Esterilidad
 Medios Definidos o Complejos

Medios Mnimos (definidos) o Ricos

(complejos).
Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)
son conocidos.

Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:

Componente Gramos/litro
Glucosa 5 Fuente de C y
energa
Na2HPO4 6 Buffer, fuente de P

KH2PO4 3 Buffer, fuente de P

NH4Cl 1 Fuente de N

NaCl 0.5 Fuente de Na

MgSO47H2O 0.12 Fuente de Mg

CaCl22H2O 0.01 Fuente de Ca

Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composicin exacta de
desconoce (extractos, peptonas, etc).

Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:

Componente Gramos/litro
Extracto de 5 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas y
carne micronutrientes. Tambin fuente de C.
Peptona 6 Fuente de aminocidos, nucletidos, vitaminas y
micronutrientes. Tambin fuente de C.
Glucosa 5 Fuente de C y energa.

Na2HPO412H2O 4 Buffer y fuente de P.

FeSO47H2O 0.3 Indicador de produccin de H2S. Fuente de Fe
y S.
Indicador 8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos
Sulfito de
Bismuto
Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

gar 20
Peptonas: pptidos (aminocidos libres), carbono y nucletidos.

Peptona de casena (triptona): degradacin pancretica de la

casena.

Peptona de carne: degradacin pancretica de la carne.

Peptona de gelatina: degradacin pancretica de la gelatina.

Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporcin

de pptidos de menor PM, aminocidos libres y factores de
crecimiento.

Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura

autolizada. Alto contenido de vitaminas.
Medio Mnimo: posee la mnima cantidad de nutrientes requeridos
para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.

Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia

(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios
complejos.

Por ej: Luria-Bertani (LB):

Componente Gramos/litro

Triptona 10 Aminocidos, carbono, energa, macro y

micronutrientes.
Extracto de 5 Vitaminas, macro y micronutrientes.
Levadura
NaCl 10 Balance osmtico.
Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el
aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el
cultivo en el organismo de inters.

Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un

grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej:
sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram
positivos.

Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algn

cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reaccin
qumica. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo
cuando el pH del medio es cido (permite distinguir a las bacterias
que fermentan lactosa).

Medio Selectivo y Diferencial.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):

1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en

un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.

3. Estriar en medio selectivo (adems puede ser diferencial).

Obtencin de colonias aisladas.

4. Tincin de Gram

5. Pruebas Bioqumicas: TP Nro. 5.

 Enterobacterias
-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Fermentadores de glucosa
Anaerobios facultativos
Flagelos peritricos
Escherichia coli (algunas cepas patgenas)
Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patgenas.
Oxidasa negativos
Aislamiento de Enterobacterias (agua)

1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y

selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.

Peptona de Casena
Lactosa
Bilis de Buey
Prpura de Bromocresol
pH= 7,40,2

Incubar por 48 hs a 37C

Si hay fermentacin de lactosa:

Slo cido Coliformes, sin E. coli

Gas + cido E.coli (junto a otras coliformes)
 Aislamiento de Enterobacterias (agua)

Crecimiento en Cambio de Formacin de

Caldo Mac Conkey color a Gas
amarillo
Escherichia coli Bueno S S
(lactosa +)
Enterobacter Bueno S S
cloacae
(lactosa +)
Klebsiella pneumoniae Bueno S S
(lactosa +)

Proteus mirabilis Bueno No No

Pseudomonas Malo
aeruginosa
Staphylococcus Malo
aureus

Si hay formacin de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el

siguiente paso es estriar en gar Mac Conkey y gar EMB.
 Aislamiento de Enterobacterias (agua)

2. gar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.

Peptona de Casena
Peptona de Carne Apariencia de las Microorganismo
Cloruro de Sodio colonias
Lactosa Grandes, rojas, con Escherichia coli (lactosa +)
Sales biliares halo
Cristal violeta Grandes, rosadas, Enterobacter spp., Klebsiella
Rojo Neutro mucoides spp. (lactosa +)
pH= 7,10,1 Incoloras, Salmonella spp., Shigella spp.,
Incubar por 24 hs transparentes Proteus spp.
a 37C Pequeas, opacas, Enterococci, Staphylococci
aisladas
 gar Mac Conkey

Lactosa + Lactosa -

Escherichia coli Salmonella typhimurium

Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. gar EMB: medio selectivo y diferencial
(enterobacterias patgenas).

Peptona de Carne
Hidrgenofosfato dipotsico
Lactosa
Sacarosa Apariencia de las Microorganismo
colonias
Eosina Amarillenta
Transparentes, de color Salmonella spp., Shigella spp.
Azul de Metileno
mbar
pH=7,00,2
Verdosas con brillo Escherichia coli (lactosa +,
metlico a la luz sacarosa +)
Incubar por 24 hs reflejada, con el centro
a 37C negroazulado a la luz
transmitida
Ms grandes que las de Enterobacter spp., Klebsiella
E. coli, mucosas, spp. (lactosa+, sacarosa-)
confluentes, con el
centro pardo-grisceo a
la luz transmitida
 gar EMB

Lactosa + Lactosa +

Escherichia coli Enterobacter spp.

 Pseudomonas spp.
-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Aerobios estrictos
Con flagelos polares
Producen pigmentos
No fermentadores
Oxidasa positivos
Patgenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos
Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)

1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42C:

enriquecimiento y seleccin.

2. Estriar en gar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas

aeruginosa

Peptona de Gelatina
MgCl2
Cetrimida
Glicerina
SO4K2

Incubar por 48 hs a 37C.

Pseudomonas aeruginosa
 Staphylococcus spp.
Cocos Gram positivos
Anaerobios facultativos
Fermentan glucosa (ac. lctico)
Asociados a piel y mucosas
Patgenos (S. aureus)
Resisten altas concentraciones salinas
 Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)

1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura

ambiente)

2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazn (con NaCl 13%): medio selectivo
para Estafilococos patgenos.

Infusin de cerebro
Infusin de corazn
Proteosa peptona
D(+) Glucosa
NaCl (7.5% final)
Hidrgenofosfato disdico
pH=7,40,2

Incubar por 48 hs a 37C

Si hay crecimiento, estriar en gar manitol salado-rojo fenol y gar azida

Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. gar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite
distinguir entre S. aureus y otras especies no patgenas).

Peptona de carne Apariencia de las colonias Microorganismo

Extracto de carne
Con halo amarillo, Manitol-positivos: S.
NaCl 7.5%
luminoso; crecimiento aureus
D(-)Manitol
Rojo fenol intenso
pH=7,40,2 Sin cambio de color; poco Manitol-negativos: S.
crecimiento epidermidis y otros.
Incubar por 48 hs a 37C

1. S. aureus
2. S. epidermidis
3. Micrococcus luteus

3. gar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.

Incubar por 48 hs a 37C
 Bacillus spp.
Bacilos Gram positivos
Forman endosporas
Generalmente mviles con flagelos peritricos
Aerobios (facultativos)
B. cereus (alimentos)
B. anthracis
Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)

1. Arroz en PBS (80C por 5 min.): seleccin.

2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.
3. Incubar por 48 hs a 37C.
4. Estriar en gar Mossel con emulsin de yema de huevo: selectivo y
diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)

Peptona de carne
Extracto de carne
D(-)Manitol
NaCl
Rojo Fenol
Emulsin de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37C.

Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado

blanco (Manitol y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

 Lactobacillus spp.
Bacilos o cocobacilos Gram positivos
Fermentadores lcticos
Aerobios facultativos o microaerfilos
Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)

1. gar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento

selectivo.
Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.
pH = 5.7.
Incubacin en microaerobiosis.

2. gar Rogosa: medio ms selectivo que el

anterior, con mayores concentraciones de
acetato y pH = 5.5 que inhiben flora
acompaante.
Incubacin en microaerobiosis.
gar MRS-Lactobacillus casei
 Azotobacter spp.
Bacilos o cocos Gram negativos
Habitan en el suelo y en el agua
Fijan nitrgeno atmosfrico (N2 a NH3)
Vida libre
Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de

nitrgeno. Contiene manitol (azcar fermentable).
Crecimiento a 28C.
 Microorganismo Enriquecimiento Seleccin-
-Seleccin Diferenciacin
Agua Enterobacterias Caldo Mc gar Mc Conkey
Conkey y gar EMB
Agua Pseudomonas Caldo M9-42C gar Cetrimida
Ricota Staphylococcus Caldo cerebro- gar manitol
corazn con salado rojo
7.5% NaCl fenol y gar
azida
Arroz Bacillus 80C y caldo gar Mossel con
nutritivo emulsin de
yema de huevo y
PmB.
Yogurt Lactobacillus gar MRS gar Rogosa
Microaerobiosis Microaerobiosis
Tierra Azotobacter Caldo Fred& gar Fred &
Waskman-28C Waskman-28C