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Repasemos
MUY SENSIBLE
Y
MUY ESPECFICA
PCR
PCR
Desnaturalizacin
Primers
complementarios
Apareamiento
Elongacin
PCR
PCR
Semi-
Gold Standard Cuantitativa
cuantitativa
No requieren Requiere
Requiere
amplificacin amplificacin
amplificacin
Grandes Pequeas
Pequeas
cantidades de cantidades
cantidades
ARN de ARN
de ARN
Radioactivida Sensible
Sensible
d
PCR en
PCRTiempo
en tiempoReal: Pasos
real: Pasos
Sntesis de cDNA
Datos normalizados
Anlisis de Datos
PCRPCR
en en
Tiempo Real
tiempo real
Extraccin de
ARN
28 S
18 S
5S
28 S
18 S
5S
Muestra
PCRPCR
en en
Tiempo Real
tiempo real
mRNA cDNA
Retrovirus
mRNA cDNA
Copia de la primera
hebra de cDNA
Digestin y
desplazamiento
del mARN
Copia de la segunda
hebra de cDNA
PCR en Tiempo Real
DETECCIN: AGENTES
INTERCALANTES O SONDAS
Agentes intercalantes
Sondas de Hibridacin
PCR en tiempo real
Colorantes de unin al ADN: SYBR GREEN
Fluorescencia
PCR en tiempo real
Molecular Beacons
Fase Plateau
Fase Exponencial
PCR en Tiempo Real
Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habr un
aumento ms rpido de la seal fluorescente, resultando
en un Ct ms bajo.
PCR en Tiempo Real
Cuantificacin Absoluta
Se determina la concentracin de las muestras.
Se necesita un estndar (ARN, ADN o cADN) cuya concentracin se
conozca con total exactitud.
Se realiza una curva de diluciones con las concentraciones conocidas
del estndar.
Se intrapola el valor de Ct obtenido para conocer la concentracin de
ADN inicial de la muestra.
Se utiliza para determinar la carga viral de una muestra.
PCR en Tiempo Real
Cuantificacin Relativa
Se necesita un control interno o calibrador (housekeeping gene).
Se determina cambios en el nivel de expresin de las muestras
basados en una muestra de referencia o estndar.
Se utiliza para comparar los niveles de expresin de un
determinado gen en muestras diferentes (por ejemplo tratadas o
no).
PCR tradicional vs. PCR en tiempo real
PCR en tiempo real
Beneficios
No requiere manipulacin post-amplificacin.
Mtodo muy sensible.
Puede detectar una simple copia de un transcripto especfico.
Puede detectar diferencias de expresin menores al 23%.
Requiere menos cantidad de RNA.
Desventajas
DNA:
Identificacin de genes de virulencia o de resistencia a drogas.
Genotipificacin de cepas o subespecies
Deteccin de mutaciones puntuales
Estudio de de polimorfismos de un solo nucletido (SNPs)
Cuantificacin del nmero de copias por clula, o determinacin de clulas
iniciales en una muestra.
RNA:
Deteccin de la expresin de genes
Efecto de mutaciones sobre la expresin
Anlisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial
Cuantificacin de la expresin
PCRPCR
enentiempo
tiempo real
real
Aplicaciones en Diagnstico Clnico
E. Coli 52C
P. Aeruginosa 57C
Aplicaciones de la Real Time PCR en el diagnstico de la
infeccin por C. Trachomatis y N. gonorrhoeae
COBAS AMPLICOR CT/NG Test (Roche )
PREDICE LA
RESPUESTA AL
TRATAMIENTO
ANTIVIRAL EN
PACIENTES HCV +