METODE MOLECULARE DE

ANALIZA A ACIZILOR
NUCLEICI
CURS 1
Dr. CS I Gabriela Oprisan
Dr. CSI Adrian Onu
INC Cantacuzino
 Cum gasesti acul in carul cu
fin?
Cum identificam o gena dintr-un genom care poate
contine mii de gene? Avem cel putin 3 variante:

1. Polymerase chain reaction (PCR) prin care

se obtin milioane de copii ale unei portiuni din ADN

2. Clonarea moleculara: inserarea unui fragment

de ADN intr-un genom bacterian si apoi multiplicarea
bacteriilor intr-un mediu de crestere specific

3. Hibridizarea: se selecteaza (sau sintetizeaza)

un ADN monocatenar marcat (radioactiv sau cu
fluorocromi) care va hibridiza cu gena tinta conform
complementaritatii bazelor azotate
 Tehnologia ADN
- recombinant
Analiza cu enzime de restrictie: Enzimele de
restrictie cliveaza ADN la nivelul unor
secvente specifice ceea ce a facilitat ingineria
genetica prin izolarea, modificarea si
transferul unor gene dintr-un organism in altul

- Amplificarea genica prin PCR: permite copierea

(amplificarea) unui fragment de ADN

- Hibridizarea ADN a permis identificarea unei

secvente specifice de ADN sau ARN intr-o
populatie de acizi nucleici
-Secventierea ADN a permis determinarea
ordinii nucleotidelor in genom si, implicit,
aflarea secventei de aminoacizi din proteine
prin utilizarea bioinformaticii

-Tot prin secventiere au fost identificate

granitele dintre gene (fiecare gena incepe si se
termina cu semnalele start si, respectiv, stop)

-Clonarea: moleculele de ADN pot fi tranferate

intr-un nou organism si pot fi multiplicate in
milioane de copii ale unei singure molecule de
ADN

Toate aceste metode sunt utilizate in ingineria

genetica
 Cromozomii, genele si ADN
Gena
Nucleu
Celula Cromozomi

Proteina

Dupa Understanding Gene Testing, NIH, 1995 si Stephen B. Gruber

 Structura virusurilor

Calicivirus

Capsida proteica

Virusul gripal
Structura ADN
 Structura acizilor nucleici
Acizii nucleici reprezint lanuri
polinucleotidice, formate din nucleotide.
Acestea sunt formate dintr-un radical fosfat,
o pentoz (un zahar) i o baz azotat.
Lanurile polinucleotidice sunt bazate pe
legturi covalente n interiorul lanului i
legturi de hidrogen ntre lanuri.
Ele se formeaz intre 2 nucleotide diferite,
de ex.: ntre adenin i timin/uracil sau ntre
citozin i guanin)
 Transcrierea ADN si Translatia

Lantul de
aac in
formare

ARNm
Ribozom Proteina

Membrana
ADN nucleara

Understanding Gene Testing, NIH, 1995

 Codul genetic

Codonul este format din 3 perechi de baze

64 codoni in total

61 codoni pt. 20 3 codoni stop

aminoacizi
(cod genetic redundant )

A U G G C A U A A

Met Ala
 Studiul acizilor nucleici
Extractia si purificarea acizilor nucleici
1. Omogenizarea si
disruperea materialului
biologic

Proba biologica: tesut, culturi

de celule eucariote, culturi
bacteriene
Omogenizator Potter
Distrugerea structurii
tesuturilor si celulelor

Omogenizator Potter

Mojar cu pistil-congelarea
probei in N2 lichid

Enzimatica Mojar cu pistil

2. Extractia ADN prin metoda PCI
phenol chloroform iso-amilic alcohol 25:24:1 v/v, pH 7.5

a) Omogenizatul este amestecat cu PCIA

b) Fazele apoasa si organica sunt separate

prin centrifugare
faza apoasa: ADN

c) Faza apoasa continand ADN este preluata interfaza: proteine

faza organica: ARN,
lipide
d) Proteinele contaminante sunt precipitate

e) ADN este precipitat cu etanol absolut

f) ADN este spalat cu alcool etilic 75%

g) ADN este dizolvat in apa ultrapura sau in

tampon TE
3. Extractia acizilor nucleici utilizand coloane de silice
 Analiza cu enzime de
restrictie
Enzimele de restrictie
Enzime izolate din bacterii
Enzimele de restrictie numite si Endonucleaze de
restricie sunt enzime care recunosc secvene de
ADN specifice, scurte
Legarea enzimei la situsul de restrictie este urmat
de clivare, fie la situsul de recunoastere, fie la o
distan oarecare de acesta, n funcie de tipul de
enzim
Endonucleazele taie ADN bicatenar in secvente
specifice prin clivarea legaturilor fosfodiester care
leaga nucleotidele adiacente
Analiza de laborator cu enzime de
restrictie
Enzimele de restrictie sunt prezente la bacterii ca sisteme
de aparare - ex. bacteria E. coli prezinta un sistem
enzimatic care recunoaste si distruge ADN strin
Pentru analiza de restrictie se utilizeaza enzime
extrase din bacterii sau obtinute prin inginerie
genetica
Tehnica de laborator presupune incubarea tuburilor
intr-o baie de apa la temperatura de 37 gr. C (pt
majoritatea enzimelor) timp de 2-3 ore
Tuburile Eppendorf contin ADN impreuna cu enzima de
restrictie si tamponul specific
Denumirea enzimelor de restrictie in functie de
genul, specia, tulpina si tipul bacteriei de la care
provin. Exemplu: EcoR I1I
Gen: Escherichia
Specie: coli
Tulpina (strain in engl.): R
Ordinea in care a fost descoperita: 11
 Enzimele de restrictie recunosc situsuri
de restrictie specifice de 4-8 pb
Aplicatiile restrictiei enzimatice
Polimorfismul lungimii fragmentelor de
restricie sau RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Dupa incubarea ADN cu enzima de restrictie se
obtin fragmente care vor fi separate prin
electroforeza
intr-un gel de agaroza
Digestia cu anumite endonucleaze de restricie a
unui produs PCR va produce un profil unic de benzi
n gelul de agaroza (RFLP)
Asocierea PCR cu analiza fragmentelor de restricie
ofer metode simple, rapide i sensibile pentru
diferentierea unor tulpini bacteriene sau
virale si pentru detectarea unor boli genetice
(ex. diagnosticul molecular al -talasemiilor)
 Aplicatiile restrictiei enzimatice

Polimorfismul lungimii fragmentelor

de restricie sau RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism)
Termenul de polimorfism se refera, in cazul
genomului uman, la diferente mici intre
indivizi
In functie de situsurile de restrictie care
exista in genomul fiecarui individ, prin RFLP
vor aparea diferente de lungime a
fragmentelor obtinute prin digestia
enzimatica a unei portiuni din genom
 Exemplu de RFLP in cazul unei mutatii care
afecteaza unul din situsurile de clivare (restrictie) cu
enzima EcoR1

EcoR1 EcoR1

TTCGTCGAATTCGTTATGCGAATTCTGCATAATGGTC

EcoR1

TTCGTCGAATTCGTTATGCTAATTCTGCATAATGGTC
Polimorfismul in ADN uman
Modificari in secventa ADN

Proteina Proteina ramine functionala

sau poate aparea boala
 Analiza STR - Short Tandem Repe
- In portiunile necodificatoare din genomul uman
exista sateliti ADN care reprezinta serii lungi de
secvente repetate numite Short Tandem Repeats
(STRs)
- La nivel individual noi avem diferente in distributia
acestor sateliti ADN
- Prin analiza cu enzime de restrictie in zonele
genomice care contin STR se vor obtine modele
diferite (pattern-uri) ale fragmentelor de restrictie si
acestea se pot vizualiza prin separare in gel de
agaroza

http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-heredity/molecular-
biology-technique/dna-profiling.html
 Analiza STR - Short Tandem Repe
- Din proba biologica (sange, saliva, sperma etc.) se
extrage ADN care este amplificat prin PCR
- Ampliconul obtinut (ADN satelit - necodant) este
supus restrictiei si astfel vor fi generate fragmente
de restrictie
-Profilul fragmentelor de restrictie (RFLP) va fi
analizat prin electroforeza

Aplicatii:

Testarea paternitatii - prin care se compara

profilul RFLP al copilului cu cel al potentialului tata
In criminalistica (Forensic) - prin care ADN
recoltat de la locul crimei va fi analizat si se vor
compara RFLP ale victimei cu cele ale suspectilor
http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-heredity/molecular-
biology-technique/dna-profiling.html
 Testul de paternitate Investigat

Copii mostenesc Profilul ADN al

jumatate din alele de la suspectului trebuie sa fie
mama si jumatate de la identic cu cel al ADN
tata astfel ca ei vor prelevat de la locul
avea o combinatie din crimei
cele doua tipuri
http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-heredity/molecular-
biology-technique/dna-profiling.html
 NC 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
MvaI MvnI Sau3AI

RFLP in 5NCR din genomul

Virusului Hepatitei C
1.1600 (genotype 4)
2.1653 (1b)
3.7151 (1b)
4.7217 (1b)
5.7330 (2)
Reacia de amplificare enzimatic
(polimerizare n lan) PCR

Dezvoltarea tehnicii are la baza descoperirea

Polimerazei Taq (din bacteria Thermus aquaticus)
n 1976

polimeraza stabil la temperaturi nalte (~ 94o C),

la care moleculele de ADN, n mod normal dublu
catenare, disociaz i astfel fiecare catena poate fi
copiat.

Reacia de amplificare enzimatic permite

obinerea unei cantiti semnificative de ADN
pornind de la cantiti infime. ADN-ul obinut este
identic cu cel iniial, aceasta reprezentnd matria.

Reacia n sine a fost inventata de de Kary Mullis n

1983.
 Aplicaiile PCR

Principala aplicaie este cea analitic -

prin amplificarea unei cantiti mici de
ADN, se poate detecta prezena sau se pot
caracteriza moleculele de studiat

O alt aplicaie este preparativ -

fragmentele de ADN se pot modifica
pentru introducerea de situsuri de
restricie (n scopul clonrii) sau
introducerea unor elemente funcionale,
tehnici denumite generic mutagenez
dirijat

PCR reprezint sinteza in vitro a unor
secvene de ADN. Aceast reacie imit
replicarea ADN-ului in vivo. Diferena
const n faptul c denaturarea nu este
realizata enzimatic ci termic

Denaturarea fiind termic, se pot folosi

pentru PCR diferite polimeraze
termostabile, extrase din bacteriile
termofile (cresc in izvoare termale)
 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Izolarea acizilor Hibridizarea Repetarea Ampliconii

nucleici primerilor si Ex. 35 cicluri obtinuti
si extensia
Denaturarea

Secventa de
amplificat prin PCR
 Hibridizarea
ADN-ADN sau ADN-ARN
Daca cele doua catene ale ADN sunt
desfacute prin denaturare ele se pot asocia
(hibridiza) cu un alt ADN (sau ARN)
complementar

Prin marcarea (cu radioizotopi sau

fluorocromi) a uneia din catenele de ADN sau
a unui fragment de ADN monocatenar
sintetic (sonda, denumita probe in
engleza) pot fi identificate moleculele
complementare care au hibridizat
 HIBRIDIZAREA
Aplicatii:
-Southern blot: ADN digerat cu o enzima de
restrictie, fragmentele obtinute separate prin
electroforeza in gel de agaroza si transferate
pe o membrana (blot) unde sunt hibridizate
cu o sonda ADN sau ARN marcata

-Northern blot: se utilizeaza ARN in locul

ADN
-
-Hibridizare in situ: sondele marcate
hibridizeaza direct in preparate celulare sau
tisulare

-Tehnologia microarray
 Hibridizarea
Toate moleculele de ADN trebuie sa
fie monocatenare (denaturate la
temperaturi ridicate sau in prezenta
NaOH). Hibridizarea moleculelor
complementare de ADN are loc in
solutii saline la aprox. 60oC.
Stringenta: cit de bine se potrivesc
cele doua catene care hibridizeaza? In
conditii de stringenta joasa catenele
nu hibridizeaza pe toata lungimea
Cinetica asociere-disociere depinde de
conc. ADN, de lungimea catenelor cit
si de continutul in Guanina/Citozina
(GC)
Autoradiografia = pentru molecule de
acizi nucleici marcate cu izotopi
radioactivi
 SOUTHERN BLOT
Pregatirea ADN pentru analiza

Centrifugare
Proba de sange ADN obtinut
si extragerea pentru analiza
ADN din
leucocite
SINGLE-STRANDED
DNA PROBES
FOR GENE A
C

B MIXTURE OF
+ SINGLE-STRANDED
DNA MOLECULES

E A

C
C

B B D
A A

E
E

F F

ONLY A FORMS A STABLE A, C, E ALL FORM

DOUBLE-STRANDED COMPLEXES STABLE COMPLEXES

STRINGENT HYBRIDIZATION REDUCED-STRINGENCY HYBRIDIZATION

 Principiul Southern blot
hibridizarea unor sonde marcate cu moleculele de ADN

Electroforeza Transfer pe
o
membrana
de celuloza

Taierea ADN cu enzime de

restrictie

Incubare in
prezenta
sondelor ADN
marcate
 Electroforeza ADN
Fragmentele de ADN incarcate in godeuri cu pipeta autom
_
Fragmentele de
ADN separate in
functie de marime
si sarcina electrica
Circuit electric

Directia migrarii

+
Gel de agaroza cu bromura de etidiu
Vizualizare la lampa de UV