Hongos del Suelo

Saprfitos y Patgenos
de Plantas

Ludwigg H. Pfenning y Lucas

Magalhes de Abreu
 PRESENTADO
Mery Alejandra Flrez
Wendy Carolina Vallejo
Yesid Patio Obregn
Venus del Carmen Quiones
Alma Lucely Riascos
 OBJETIVO
Contribuir al establecimiento de una
serie de mtodos estndares,
generalmente aceptados.

Evaluar la diversidad de hongos en

suelos tropicales bajo diferentes usos
de suelo.
 INTRODUCCIN

En el suelo, los hongos interactan con una compleja

comunidad microbiana que incluye: Bacterias,
actinomicetos (actinobacterias) y pequeos
invertebrados.

Los hongos son una parte importante de la cadena

alimenticia en el suelo principalmente para la
mesofauna que habita en el suelo (Bonkwski et
al.,2000).
IMPORTANCIA ECOLOGICA DE
LOS HONGOS EN EL SUELO
Los hongos del suelo juegan un papel clave en los
procesos de descomposicin, mineralizacin y
reciclando los nutrientes de las plantas.

Saprofitos: Tienen una especificidad limitada por

sustratos.

En sistemas agrcolas, los patgenos de plantas y

sus antagonistas son particularmente importantes.
Los patgenos de plantas actan en el suelo.
HONGOS
Zygomycetes: Ascomycetes:
PATOGENOS INFECTAN

TOMADO DE: search?

q=zygomycetes&client=firefox-22/11/2016
SUPRESIN DE PATOGENO EN
LAS PLANTAS

Puede resultar intrnseca en los

suelos, pero tambin es posible que
se mantenga o incremente con
algunas prcticas agrcolas
 Plantas utilizadas como
Materia
cubierta vegetal
orgnica

Diversificacin de
cultivos
ASPECTOS DE
SISTEMTICA
MODERNA
 Protozoa
Los hongos del reino Protozoa son
numerosos, aunque algunos de ellos
son importantes patgenos de las
plantas del suelo.

1. Spongospora subterranea
2. Plasmodiophora brassicae o
3. Polymyxa graminis.
ESTAS ESPECIES SE CLASIFICAN
EN LA CLASE
(Plasmodiophoromycetes)

Spongospora Plasmodiophora
subterranea
brassicae
Scabbed appearance on potato (Photo: Melodie Putnam, Oregon State University Plant Clinic)
 Chromista
Los hongos que son
derivados de algas y que
contienen celulosa como
el mayor componente en
su pared celular
pertenecen al reino
Chromista Filum
Oomycota

(Dick, 2001; Kirk et al.,

2001).

Tomado de :/search?
q=zygomycetes&client=firefox/22/11/201
6
 Glomeromycota

Estos hongos son clasificados en el reino Fung se

caracterizan por tener quitina como el mayor
componente en su pared celular. los gneros que
pertenecen al filum Glomeromycota forman
micorrizas arbusculares y no crecen en ausencia
de su planta hospedera.

(Schuler et al., 2001; Moreira y Siqueira, 2002).

 Chytridiomycota
El nico grupo dentro
del reino de los hongos
que forma esporas
flageladas algunos de
estos hongos habitan en
el suelo, pero
normalmente son
acuticos y viven como
saprfitos o parsitos de
otros organismos como
Tomado:www.google.com/search?
nematodos, insectos,
q=zygomycetes&clien/22/11/2016
plantas u otros hongos.
(Krik et al., 2008).
 Zygomycota

Estos se consideran
como hongos de
azcar por su
preferencia por
carbohidratos simples
y por su crecimiento Tomado:www.google.com/search?
vigoroso en un cultivo q=zygomycetes&clien/22/11/2016
axnico.
 Basidiomycota
Se caracteriza por el
basidium, un
meiosporangio en el
que generalmente se
forman cuatro esporas
sexuales (Bauer et al.,
2006). y en la mayora
de los casos por la
formacin de un
cuerpo fructfero. search?
q=Basidiomycota&client=firefox/22/11/201
6
 Ascomycota
Se caracterizan por la formacin de las ascas, una
estructura formada durante la fase sexual de su ciclo
de vida. La fase asexual de los ascomycetes se llama
anamrfica y es la fase ms comnmente encontrada.
Algunos de los ascomycetes como Aspergillus y
Penicillium que habitan en el suelo, pertenecen a los
plectomycetes, ascomycetes que forman un asca en
un cuerpo fructfero cleistotecal. Probablemente, el
grupo ms grande de hongos encontrados en el suelo
son los pyrenomycetes anamorfos

(Krik et al., 2008).

 MUESTREO DE SUELO

Utilizando un nucleador se extraen pequeas cantidades

de suelo, a una profundidad de 20 cm en 12 puntos
distribuidos en cada parcela. Cada juego de 12 muestras
se homogenizan para formar una muestra compuesta de
alrededor de 500 g que se coloca en una bolsa de
plstico de manera alternativa.

Para la extraccin del DNA, las muestras del suelo

debern trasladarse al laboratorio utilizando un
recipiente con aislamiento, preferentemente a 4C y
congelarse lo ms pronto posible para su futuro
procesamiento.
(NUCLEADOR, ESPTULA, AZADN, ETC.)

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/459/
cap3.html
EVALUACIN DE LOS HONGOS DEL
SUELO: PROCEDIMIENTOS
BASADOS EN CULT IVOS
Todos los mtodos
La rizosfera tambin
propuestos dependen
contiene una alta
de muestras del suelo y
concentracin de
no contemplan el uso
bacterias que, a pesar
de races para aislar
del uso de antibiticos
hongos del suelo,
en los medios de
debido a que la
cultivo, pueden resultar
micobiota de la
rizosfera es altamente contraproducentes para
influenciada por las la recuperacin de
especies de plantas. especies de hongos.
 OOMYCOTA: USO DE CEBOS PARA EL
AISLAMIENTO DE
PYTHIUM Y PHYTOPHTHORA
Alcuotas de 2 g de suelo se El micelio del hongo
traspasan a cajas Petri que
contienen agua estril destilada. formado en el sustrato
Se aaden granos de sorgo como deber traspasarse a
cebo y se incuban por cinco das;
despus se comprueba la charolas con el medio
presencia de micelio en el cebo. MP5 (en el caso de
Saprolegniaceae) y
El micelio del hongo formado en agar con harina de
el sustrato deber traspasarse a maz (AHM), agar
charolas con el medio MP5 (en el
caso de Saprolegniaceae) y agar
dextrosa y papa (ADP)
con harina de maz (AHM), agar o agar de papa y
dextrosa y papa (ADP) o agar de
papa y zanahoria (en el caso de
zanahoria (en el caso
Pythiaceae). de Pythiaceae)
 USO DE CEBOS PARA EL
AISLAMIENTO DE CHYTRIDIOMYCOTA
El aislamiento de
colonias
individuales en un
medio de cultivo
axnico es difcil, la
caracterizacin e
identificacin se
hace directamente
en el cebo.
 Basidiomycota
Rhizoctonia: tcnica de
cebo y aislamiento
directo de partculas de
suelo
 MTODO DE PARTCULAS DE
SUELO
1. Una suspensin de 10 g de muestra de suelo y agua de
la llave es agitada, despus decantada usando un tamiz
de 0.5mm.
2. El suelo retenido se pasa varias veces por el tamiz.
3. Las partculas de suelo retenidas se secan con papel
absorbente estril y se transfieren a una caja Petri de 15
cm de dimetro que contenga un medio de agar con
agua acidificada (al 2%) con 250 mg L- de cloranfenico.
4. Despus de un periodo de incubacin de 24 a 48 horas,
a 25C, se verifica el crecimiento tpico de Rhizoctonia;
se evala la frecuencia de la colonizacin en las
partculas del suelo y el micelio se transfiere a ADP para
su eventual caracterizacin (Sneh et al., 1991).
 TCNICA DE CEBO

1. Se mezcla 1 g de semillas de betabel (remolacha)

con 100 g de suelo hmedo en cajas Petri.
2. En un periodo de incubacin de 48 horas a 25C, se
recuperan las semillas con un tamiz de 1.5 mm;
posteriormente se lava con agua destilada durante
20minuto, se seca con papel absorbente estril
para ser transferidas a un medio de agar con agua
al 2%, que contenga 100 mg L- de cloranfenicol. El
crecimiento de Rhizoctonia se verifica y se
transfiere micelio a ADP para su aislamiento y
caracterizacin (Papavizas et al., 1975)
ASCOMYCOTA: TCNICA DE LAVADO
DEL SUELO Y FILTRACIN DE
PARTCULAS

ste es el mayor grupo de hongos del suelo que

incluye especies saprfitas, entomopatgenas,
fitopatgenas y sus antagonistas. Todas estas
especies exhiben una fase saprotrfica en el
suelo y pueden ser aisladas utilizando una
metodologa con placas de suelo. La tcnica de
lavado de suelo es un mtodo adecuado para el
aislamiento de estas especies
 TCNICA DE LAVADO
1. Una muestra de 10 g de suelo mineral se agita
con 200 ml de agua destilada en una centrfuga
a 180 rpm durante 10 minutos.
2. Despus de la sedimentacin de las partculas
del suelo durante 2 minutos, el sobrenadante se
desecha y se repite el procedimiento dos veces.
3. Las partculas de suelo prelavados son filtradas,
utilizando un juego de tamices de 1.0 mm, 0.7
mm, 0.5 mm y 0.21 mm usando agua destilada
(alrededor de 2 litros) por 2 minutos.
4. Los coloidales de suelo y granos de arena son
removidos del ltimo tamiz, secados con papel
absorbente esterilizado y transferidos (7
partculas por placa) a 5 cajas Petri (90 mm) que
contienen el medio de aislamiento AHM (30 g L-),
ms estreptomicina plus (50 mg L-) para la
inhibicin de bacterias y ciclosporina (10 mg L-)
o rosa de Bengala (70 mg L-), para la inhibicin
de hongos de rpido crecimiento.
 EL MTODO DE DILUCIN
DEL SUELO EN PLACA
Consiste en una cantidad conocida de suelo es
suspendida en agua estril, se toma 10% de la
suspensin, la cual se mantiene en agitacin durante
unos momentos.
De esta suspensin se prepara una serie de 10
diluciones, hasta lograr la dilucin final. Un factor
final de dilucin de 10-4 10-5 se considera
adecuado para el aislamiento de hongos (Dhingra y
Sinclair, 1985).
 ASCOMYCOTA: MEDIOS
SELECTIVOS Y TCNICA CON CEBO
Para un aislamiento Ejemplos de cebos utilizados
selectivo de grupos blanco para el aislamiento selectivo
o especies de hongos del de hongos del suelo: cabello
suelo, rutinariamente se para las especies
utilizan medios selectivos; queratinoflicas, quitina
stos pueden contener para los productores de
fuentes de carbono quitinasa, larvas de insectos
preferiblemente para los entomopatognos y
metabolizados por algunos nematodos para los hongos
grupos fisiolgicos de nematfagos.
hongos o pueden
(Marks y Mitchell, 1970; Papavizas
modificarse con qumicos
et al., 1975; Dackman et al.,1987;
que inhiben el crecimiento Sneh et al., 1991; Gams et al.,
de organismos no deseados 1998; Edena et al., 2000;
Gonalves et al., 2001; Pettitt et
al., 2002; Barratt et al., 2003;
Wellington et al., 2003).
 Procedimiento para el
aislamiento Cylindrocladium y
gneros afines del suelo,
utilizando como cebo hojas de
Ricinus communis
Cylindrocladium:es un gnero
conformado por especies
saprotrfitas y patgenas de
plantas comnmente
encontradas en el suelo.
 En el laboratorio se
utilizan hojas de
ricino (Ricinus
communis) como
cebo para el
aislamiento de
hongos del
complejo
Cylindrocladium de
manera rutinaria. http://www.eljardinbonito.es/fichas/ricino-ricinus-
communis-00.html
 PROCEDIMIENTO
1. Hojas jvenes y frescas se recogen y se lavan bajo
agua de la llave para posteriormente ser sometidas a
una desinfeccin con etanol al 70% durante un minuto
seguida de hipoclorito de sodio al 3%, durante dos
minutos.
2. Las hojas enteras se colocan un una caja Petri de
15cm y se cubren con una capa de suelo hmedo;
despus de tres das de incubacin se lavan las hojas
cuidadosamente con agua destilada y se transfieren a
una cmara hmeda, donde diariamente se verifica la
esporulacin tpica de Cylindrocladium,
Cylindrocladiella, Gliocladiospsis y otros gneros
relacionados.
Tcnica de cebo para el aislamiento
de patgenos fngicos de plntulas

Las semillas de tomate se germinan en 100 g de

suelo y se verifica si las plntulas manifiestan o no,
sntomas de podredumbre.,
Los tejidos de plntulas infectadas se esterilizan
con hipoclorito de sodio (al 2%, durante 30
segundos).
Se lavan con agua destilada y se secan en papel
absorbente esterilizado para ser transferidas a un
medio de aislamiento, tal como ADP y AM (agar
extracto de malta) que contiene cloranfenicol (250
mg L-).
 IDENTIFICACIN DE
HONGOS DE SUELO
La identificacin de hongos que
habitan el suelo puede causar
problemas para aqullos que no
tengan suficientes conocimientos de
micologa.

Las dificultades de identificar a nivel

de especie se ilustran con el gnero
Fusarium, que es un grupo
heterogneo que incluye saprfitos,
 EVALUACIN DE HONGOS DEL
SUELO: TCNICAS ESPECFICAS
DE DNA

Es una medida confiable de las comunidades de

hongos del suelo, requiere de un laborioso
programa de aislamientos sistemticos con
diferentes medios de cultivos y estrategias de
aislamiento que reflejen la inmensa diversidad
taxonmica y fisiolgica de grupos de hongos que
habitan en el suelo.
(Tsao et al., 1983; Muyzer et al.,
1993; Bridge y Spooner, 2001; Bills et
al., 2004).
EXTRACCIN
DE DNA
El total de DNA obtenido
debe estar
completamente
purificado para eliminar
sustancias hmicas y
fenlicas que interfieren
con el PCR; este paso se
logra mediante
separaciones a travs de
columnas de separacin
o con el uso de kits
comerciales de
purificacin de DNA. http://www.cientificasenna.com/index.php?
modulo=catalogo&accion=articulo&id=1326

(Liu et al., 1997; Viaud

et al., 2000; Bridge y
Spooner, 2001).
REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA. USO DE
PRIMERS ESPECFICOS PARA
HONGOS
El grupo de genes
para las molculas
de RNA Ribosomales
18S, 5.8S y 28S se
considera que son
altamente
conservados entre
los organismos
eucariticos y
normalmente se
emplean como http://www.tutorvista.com/biology/types-of-dna-
and-rna
marcadores
Los Primers permiten
la amplificacin de una
amplia gama de
especies de hongos sin
perder la especificidad
de este grupo clave.
Basndose en las
secuencias de genes de
RNA ribosoma
disponibles en bancos
de datos especializados
para varias especies de http://www.genomecompiler.com/tips-for-efficient-primer-
design/
hongos.
 MTODO DE HUELLA
MOLECULAR
(TGGE y DGGE)
En esta tcnica, las molculas 18S DNA amplificadas por PCR
son sometidas a una electroforesis en una matriz de gel con un
gradiente lineal trmico (TGGE) o con un gradiente
desnaturalizante (DGGE).

Los amplicones tienen exactamente el mismo numero de

nucletidos, pero difieren en su contenido Guanica-Citosina, lo
que determina el modo de desnaturalizacin y la movilidad
electrofortica al migrar en el gel desnaturalizante.

Los iniciadores usado en el PCR, generalmente, contienen un

DNA con bases repetitivas de GC que resultan menos
propensas a la desnaturalizacin debido a su alta estabilidad
qumica.
ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE
DESNATURALIZACIN
 CONCLUSIN
Las tcnicas de huella molecular en comunidades puede
monitorear composiciones complejas de hongos de suelo, pero
una mejor caracterizacin y anlisis filognico de taxas
dominantes, invariablemente, requieren de una secuenciacin y
comparacin utilizando bancos de datos de DNA al alcance del
pblico. Sin embargo, los enfoques taxonmicos de hongos
basados nicamente en datos moleculares, pueden presentar
algunos problemas debido a que los bancos de datos pueden
estar incompletos y puede que las secuencias de DNA se
encuentren mal identificadas, lo que origina errores en
identificaciones morfolgicas, amplificacin y secuenciacin de
contaminantes de hongos e incluso, en la secuenciacin de
quimeras.

(Crous, 2002a; Bridge et al., 2003; Hawksworth, 2004b).

 ANLISIS DE DATOS
Una lista de especies o agregados de especies
aisladas y su abundancia relativa en cada
muestra, generalmente, constituye el primer
conjunto de datos. Se verifica el nmero de
cepas de cada muestra y este dato puede ser
usado para comparar entre sitios, fechas de
colecta o diferentes tratamientos de suelo. La
prueba de independencia de Chi cuadrada
puede usarse para este anlisis, donde el
nmero total de cepas de cada muestra se usa
en comparaciones pareadas.
PRESERVACIN Y COLECCIN DE
RECURSOS GENTICOS
Las colecciones de recursos genticos hoy en da son
solicitadas en todo el mundo, con el objetivo de la
preservar las especies ex situ y de suministrar a
instituciones de investigacin.

Las colecciones de referencia deberan ser apoyadas por

pases con una poltica fuerte en ciencia y tecnologa
dado que contienen informacin acerca de la
distribucin geogrfica y de los hospederos, por lo que
proveen material de trabajo bsico para quienes
estudian las caractersticas y la variacin, al igual que
las aplicaciones prcticas y econmicas de las especies.
GRACIAS