FLUORIMETRA

Y
QUIMIOLUMINISCENCIA

Lic. T.M. Patricia Quintana del Solar

 LUMINISCENCIA

Dentro de los fenmenos

llamados luminiscencia :
Fluorescencia,
Fosforescencia
Quimioluminiscencia
 FLUORESCENCIA
Luminiscencia por rayos ultravioleta.
Proviene del mineral que presenta este
fenmeno por naturaleza, la fluorita.
La fluorescencia se produce molcula:
* Absorbe luz de una determinada longitud
de onda (energa)
* Emite luz de una longitud de onda superior
(menor energa)
 Fluorimetra
Combina la fotometra con la alta
sensibilidad y especificidad del
fenmeno fluorescente.
Para la medida de la fluorescencia
se usan:
- Fluormetros
- Espectrofluormetros
Fluorimetra
Aplicaciones en qumica clnica

Muestras biolgicas :
enzimas, vitaminas, algunos
medicamentos.
Aplicacinfluoroinmunoanlisi
s
Utiliza Ac. marcados con una
sustancia fluorescente
 FOSFORESCENCIA

Es un fenmeno en el cual
ciertas sustancias tienen la
propiedad de absorber energa
y almacenarla, para despus
emitirla gradualmente en forma
de luz
 Bioluminiscencia
fenmeno producido por
reacciones qumicas de origen
biolgico, uno de los casos
ms conocidos es la luz
emitida por las lucirnagas,
tambin algunas bacterias,
hongos.
 QUIMIOLUMINISCENCIA

La energa liberada no
slo se emite en forma
de calor o de energa
qumica sino en forma de
luz.
 QUIMIOLUMINSCENCIA
Utilizados: en anlisis bioqumico
N public./ comunicaciones
celebracin del primer
Simposium Internacional sobre
Bioluminiscencia y
Quimioluminiscencia, celebrado
en Bruselas en 1978.
 QUIMIOLUMINISCENCIA

1667,Boyle(Alemania)Luz caliente.
1887, Rad Ziszewki ->comp. qm.
propiedades luminiscentes.
En 1928, Abrech luminol
emite luz como fotones individuales.
 1947 se aisla la luciferasa
(luciernagas)

1952 Etrehler y Totter

publicaron una aplicacin
analtica especfica de la
luciferasa en un ensayo para
adenosin trifosfato (ATP).
En 1959 el trabajo de
Berson y Yalow H. insulina

Radioistopos en una tcnica

analtica conocida como
radioinmunoensayo
(RIA)Antg-Antic.
 1959 La precisin, exactitud,
simplicidad, no pudieron ser
igualadas por otras tcnicas.

El RIA En la endocrinologa
clnica para medir las hormonas
con mucha precisin.
 QUIMIOLUMINISCENCIA

1ensayo QL Schroeder
indicador de luz (isoluminol).
En 1976, una tecnologa
semiautomatizada para ensayos
al usar isoluminol (indicador)
con el requerimiento de la
adicin de un catalizador para
que la emisin de luz ocurra.
 QUIMIOLUMINISCENCIA
En 1978 muchas publicaciones
sobre el uso de otro indicador
quimioluminiscente llamado ster de
acridina.
STER DE ACRININA, no requiere la
adicin de un catalizador para que
ocurra la reaccin de emisin de luz,
en contraste con la base del sistema
de luminol.
 PERIODOS DE LA QL
1928-1940bsqueda de
nuevos compuestos o sistemas
quimioluminiscentes, por medio
de modificaciones qumicas de
estructuras
Desde la 2 Guerra Mundial
hasta el presente
LAS GRANDES APLICACIONES

Mtodo de deteccin en
inyeccin en flujo,
cromatografa lquida (CL)
Electroforesis capilar (EC)
Inmunoensayo
 QUIMIOLUMINISCENCIA

Actualmente en qumica analtica

como sistema de deteccin
Combinada con Electroforesis
capilar (EC) como mtodo
previo de separacin,
proporcionando una selectividad
y sensibilidad analtica excelentes
QUIMIOLUMINISCENCIA
1983, QL y Bl: marcadores
Falc,G-6 fosfato dhi, peroxidasa del
rbano, la luciferasa de la renilla, y la
xantina oxidasa.
Inmunoensayos usan partculas
paramagnticas (PMP) como fase slida.
La separacin es perfeccionada al
colocar los tubos en una banda
magntica
Eliminando la centrifugacin
 QUIMIOLUMINISCENCIA

Ciba Corning 1ofrecer inmunoensayos

ACS 180. totalmente automatizado.
ACS plus. con capacidad de ms
pruebas QL.
Abbot crea el Axsyn automatizado.
Sanofi Pasteur: automatizado.
Centauro + capacidad/velocidad.
QUIMIOLUMINISCENCIA
Hasta los 90 las reacciones
quimioluminiscentes: peroxioxalato,
luciferasa, lucigenina y luminol,
siendo la ms comn la reaccin
con peroxioxalato en deteccin
post-columna acoplada a
cromatografa lquida, tanto
convencional como empleando
microcolumnas.
 LAS VENTAJAS
Sensibilidad : nanog., picog.
Alta sensibilidad (fentogramos )
Velocidad (a los 15 min).
Estable por varias horas.
Procedimientos simples.
Sin residuos peligrosos
No emplea radiactividad.
No genera riesgo contaminante
Ni ruido de fondo durante el proceso
QUIMIOLUMINISCENCIA
ADVIA CENTAUR XP
QUIMIOLUMINISCENCIA

Falc
AE
 QUIMIOLUMINISCENCIA
Sistemas automatizados para el uso
de inmunoensayos por
quimioluminiscencia (emisin de luz
asociada con la energa)

Desplazando metodologas:
Radioinmunoanlisis (RIA)
Inmunoradiometra (IRMA)
Tcnica analtica Quimioluminiscente

Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac

con sustancias que participan en la
reaccin quimioluminiscente (luminol,
peroxidasa), y la quimioluminiscencia
es el paso final en la deteccin.

Se hacen en fase slida, o en tcnicas

homogneas
 TIPOS DE
QUIMIOLUMINISCENCIA

QUIMIOLUMINISCENCIA
(DIRECTA)
QUIMIOLUMISCENCIA
AMPLIFICADA
(INDIRECTA)
 QUIMIOLUMINISCENCIA
(DIRECTA)
Mide directamente la energa luminosa
Emplea como fase slida, micro partculas
paramagnticas (PMP)
Marca fluorescente el ster de acridina
(AE)
Campo magntico, los imanes atraen las
PMP unidas al antgeno o al anticuerpo
hacia ellos.
Especficos contra la sustancia a analizar.
 QUIMIOLUMISCENCIA
AMPLIFICADA (INDIRECTA)
Reacciona por enzimas (fosfatasa
alcalina) o iones utiliza tambin
catalizadores y puede necesitar o no
cofactores y el sustrato es el ster de
fostato.
Produce una fuerte emisin de luz.
Permite hacer numerosas lecturas y
aumentar la precisin.
Inmunoanlisis con reactivos
marcados

homogneos y
heterogneos
diseo competitivo o
no competitivo
Segn el diseo del ensayo

competitivos
(de reactivo limitado)

no competitivos
(de reactivo en exceso)
 Competitivos
Inmunoensayos: marcado de antgeno
o anticuerpo.
Una cantidad limitada de anticuerpos
que es insuficiente para unir todo el
antgeno.
El antgeno marcado compite con el
antgeno sin marcar por los
anticuerpos.
La cantidad de analto se determina a
partir de la regresin correspondiente.
No competitivo- sandwich de anticuerpos

Exceso de anticuerpo marcado

eliminado por lavado
bloqueante +
E
Ag
E Sustra- Seal
to

Seal Curva standard

[Ag]
Segn el diseo del ensayo

homogneos

heterogneos
 Heterogneos Homogneos
Los ms utilizados. Mas utilizados en drogas
Diversos formatos : de abuso y monitoreo de
micro placas, frmacos
partculas magnticas, Sin pasos de separacin,
Membranas de no se requiere la
nitrocelulosa, separacin del antgeno
Implican un paso de unido del no unido.
separacin del antgeno
unido del no unido.
Ejem.:
ELISA, los pasos de
lavado son etapas de
separacin.
 Heterogneos Homogneos
Ventajas Ventajas
Menos interferencias,
ms especficos y Ms precisos
sensibles Al ser en general
Instrumentacin menos automatizados se
costosa
Admiten mayor tamao
llevan a cabo sin
de muestra, as entrenamiento
disminuye el lmite de especial
deteccin.
Ms verstiles en cuanto
a tipo de analto Desventajas
Desventajas Son ms costosos
Ms difciles de en reactivos
automatizar
Mayor tiempo de anlisis
 Homogneos
La cuantificacin de la reaccin Ag-Ac en los
EIA homogneos se realiza por cambios en la
seal proveniente de la marca sin hacer
separacin fsica de las formas libre y unida.

El cambio de seal depende de la inhibicin ,

activacin o cambios conformacionales en la
enzima.

Monitoreo teraputico de frmacos (digoxina)

deteccin de drogas de abuso.
 Homogneos

Ac

Ag Ag
Enzima

Sustrato
Ag
 Homogneos

S
Ag

Enzima activa Enzima inactiva

Deteccin y Cuantificacin:
Las medidas se pueden hacer con:
- un simple espectrofotmetro
- un analizador automtico de qumica clnica.
 Inmunoanlisis con reactivos
marcados
ENZIMOINMUNOANALISIS:
Las ms utilizadas son:
peroxidasa
fosfatasa alcalina
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
B- galactosidasa
Ventajas
disponibles comercialmente
se pueden conjugar por tcnicas simples
tienen varios sustratos
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
Quimioluminiscencia electrogenerada es un
tipo de luminiscencia producida durante las
reacciones electroqumicas en soluciones.
Reaccin produce un estado
electrnicamente excitado, que luego
emite luz a la relajacin a un estado de
bajo nivel.
Esta longitud de onda del fotn de la luz
emitida corresponde a la diferencia de
energa entre estos dos estados.
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
Metodologa no isotpica basada en la
cuantificacin de una seal luminiscente
(emisin de fotones) generada a partir de
una reaccin qumica iniciada elctricamente
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
Los compuestos quimioluminiscentes
(rutenio, osmio) son fcilmente
acoplables a protenas y cidos nucleicos.
La ventaja de la iniciacin elctrica de la
reaccin qumica es que se obtiene un
control ms preciso de la reaccin.
Ofrece muy elevada sensibilidad
analtica en combinacin con tiempos
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
Complejo en la superficie del electrodo
Principales componentes
del sistema