Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Autoclave Probetas
Incubadora Embudo
Verter por medio de una pipeta el medio lquido (aproximadamente 2,0 mL por placa).
El pH final debe ser 7,0 + - 0,2. Tapar la placa de Petri.
PROCEDIMIENTO TCNICA FILTRACIN POR MEMBRANA
Seleccin del tamao de la muestra: El tamao de la muestra se regir por la densidad
bacteriana esperada y, en su caso, por los requisitos reglamentarios. Para el anlisis de agua
potable, el tamao de la muestra se limitar solamente por el grado de turbidez o por el
crecimiento no coliformes en el medio. Un volumen de muestra ideal producir de 20 a 80
colonias de coliformes totales y no ms de 200 colonias de todos los tipos.
PROCEDIMIENTO TCNICA FILTRACIN POR MEMBRANA
Filtracin de la muestra: Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros, colocar un filtro de
membrana (rejilla hacia arriba) sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas esterilizadas.
Situar el embudo previamente esterilizado sobre el soporte hasta que est fijo. Verter la muestra
de agua en el embudo y aplicar el vaco hasta que el lquido se haya filtrado.
PROCEDIMIENTO TCNICA FILTRACIN POR MEMBRANA
Desenganchar el vaco, retirar el embudo y tomar el filtro de membrana cuidadosamente con las
pinzas esterilizadas y se coloca dentro de una placa Petri sobre el medio de cultivo, con la cuadricula
hacia arriba, procurando que no se formen burbujas entre la membrana y el medio de cultivo. Las
placas se llevan a incubar en posicin invertida en la estufa por 22 a 24 horas a 35 +/- 0,5C.
Posteriormente se procedern a contar el nmero de microorganismos.
ANLISIS TCNICA FILTRACIN POR MEMBRANA
Conteo: Para contar las colonias en filtro de membrana, utilizar un gran campo de baja potencia (10 a 15x)
binocular microscopio de diseccin u otro dispositivo ptico con una fuente de luz fluorescente blanca fra dirigida a
proporcionar una visualizacin ptima.
Las colonias de E. coli son de color azul oscuro a prpura y los coliformes totales son de color salmn a rojo. Si aparecen
colonias azul claro a turquesa o incoloras, puede tratarse de otras bacterias Gram negativas. Para confirmar E.
coli puede cubrirse la colonia azul-prpura con una gota del reactivo de Kovacs. Si este reactivo da un color cereza-
rojo despus de algunos segundos, significa que son colonias indol positivo, que confirma la presencia de E. coli.
100 = 100
TCNICA NMERO MS PROBABLE POR TUBOS MLTIPLES
Caldo EC
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
Preparar caldo de Lauril triptosa a simple (1 X), doble concentracin (2X) o segn se
requiera y dispensar segn el volumen de muestra que se va a sembrar, de tal manera que
las porciones de muestra inoculadas al medio no reduzcan la concentracin de
ingredientes del medio, la cual debe mantenerse constante.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLE
Con una pipeta estril, sembrar 10 mililitros de muestra en cada uno de los 10 tubos de caldo
lauril triptosa estril de doble concentracin. Verificar que en cada tubo haya un tubo
Durham invertido.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase presuntiva)
Despus de la inoculacin de todos los volmenes de muestra, tapar y agitar
la gradilla con los tubos inoculados. Hacerlo en forma horizontal y evitando
que el medio sembrado llegue a la tapa de los tubos. Colocar la gradilla en la
incubadora a 35 0,5 C durante 24 2 horas.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase presuntiva)
Despus de la incubacin, retirar los tubos de la incubadora para
efectuar la primera lectura de los resultados. Agitar suavemente cada
tubo y examinar la produccin de gas. Retirar los tubos con resultado
positivo (produccin de gas, retenida en el tubo Durham; no es
importante la cantidad de gas) y anotar los resultados.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase presuntiva)
Devolver a la incubadora (35 0,5 C) todos los tubos con resultados
negativos, por un periodo adicional de 24 1 hora. La segunda lectura (a
las 48 3 horas) ser hecha en las mismas condiciones, despus de esta
ltima lectura. Los tubos con resultado positivo sern separados para
continuar la marcha analtica y los que resulten negativos sern
descartados.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase confirmativa)
Para coliformes totales: Agitar cada tubo positivo de la prueba presuntiva
con un asa de siembra estril. Retirar el material e inocular al tubo 10
mililitros de caldo verde brillante lactosa bilis 2% (CLVBB 2%)
correspondiente. Evitar tomar la pelcula superficial.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase confirmativa)
Para coliformes termotolerantes (fecales): La prueba confirmativa para coliformes
termotolerantes se realizar sembrando todos los tubos positivos de la prueba
presuntiva en tubos con 10 mililitros de caldo EC.
Despus de la siembra, agitar la gradilla con los tubos inoculados. Hacerlo en
forma horizontal y evitando que el medio sembrado llegue a la tapa de los tubos.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase confirmativa)
Incubar los tubos de caldo verde brillante lactosa bilis 2% sembrados a 35 0,5 C durante 24 3
horas. Despus de la incubacin, retirarlos tubos para efectuar la primera lectura. Agitar
suavemente cada tubo y examinar la produccin de gas. Retirar los tubos con resulta-do positivo
(produccin de gas en el tubo Durham; no es importante la cantidad de gas) y anotarlos
resultados.
Volver a incubar los tubos negativos a 35 0,5 C durante24 1 horas y repetir el procedimiento de
lectura. Anotar los resultados.
PROCEDIMIENTO TCNICA NMP POR TUBOS MLTIPLES
(Fase confirmativa)
Volver a incubar los tubos negativos a 35 0,5 C durante24 1 horas y repetir el procedimiento de lectura. Anotar los
resultados.
Incubar todos los tubos de caldo EC inoculados (no ms de 30 minutos despus de la inoculacin) en bao Mara a
44,5 0,2 C durante 24 2 horas.
Proceder a la lectura considerando como resultado positivo para la prueba todos los tubos que presentaron
formacin de gas en el tubo Durham.
CALCULO DEL NMERO MS PROBABLE
Para muestras de agua tratada, es decir, las inoculadas en cinco tubos con 20mL cada uno
(Utilizar tabla No.12) o las inoculadas en diez tubos con 10mL cada uno (Utilizar tabla No.13).
CALCULO DEL NMERO MS PROBABLE
Para muestras de agua sin
tratamiento, es decir, las
inoculadas en tres series de cinco
tubos con volmenes de 10
mililitros, 1 mililitro y 0,1mililitros, el
Nmero Ms Probable se obtiene
de la tabla 14.
10
100 = 100
Donde, : volumen ms
bajo de la porcin de la
muestra seleccionada a la
dilucin.
Presencia / Ausencia
Una autoclave
Un destilador de agua
botellas graduadas con tapa rosca estril de 100 mililitros (si se usan botellas sin graduaciones, la muestra debe medirse con probeta
graduada de 100 mililitros)
Probetas estriles
tubos de ensayo de 250 mililitros con tapa rosca o frascos de vidrio estriles y de boca ancha (solo en el caso de usar caldo P-A)
tubos de ensayo pequeos para utilizarlos como campanas de fermentacin dentro del tubo de ensayo grande (si se usa el caldo
lauril triptosa)
tubos Durham
tubos de 16 x 150 mm
Expresar como:
Presencia (o ausencia) de coliformes totales /100 mL
Presencia (o ausencia) de coliformes fecales /100 mL.
Enzima Sustrato
Esta prueba es un procedimiento simplificado para la determinacin
simultnea de enzimas de coliformes totales y E. coli. en agua destinada
al consumo humano.
La inclusin de un sustrato hidrolizable cromognico (productor de color
en presencia de enzimas de coliformes) y otro fluorognico (productor de
fluorescencia en presencia de enzimas de E. coli) permite la deteccin de
bacterias coliformes totales y de E. coli.
Se recomienda tomar otra muestra en el mismo punto y efectuar
un anlisis cuantitativo.
Equipos y materiales.
Una autoclave
Un horno de aire caliente o estufa para esterilizacin
Un destilador de agua
Un potencimetro o cinta de pH universal
Incubadora a 35 0,5 C
Un mechero a gas o alcohol
Una botella transparente no fluorescente de vidrio boro silicato o equivalente con tapa rosca estril de 100
mililitros
Un frasco estril para el muestreo
Una probeta estril
Lmpara de rayos ultravioleta (366 nanmetros de longitud de onda)
Un comparador de color y de fluorescencia.
Procedimiento.
Retirar la envoltura de papel del frasco con la muestra de agua.
Homogeneizar la muestra agitando fuertemente 25 veces.
En condiciones de asepsia, verterla muestra dentro de la botella estril hasta 100 mililitros. Si
el frasco es graduado, incorporar los100 mililitros de la muestra en forma directa. Si el frasco
no es graduado, usar una probeta estril.
Adicionar el reactivo con sustrato enzimtico.
Colocar la tapa del frasco y mezclar hasta que la mezcla se vuelva uniforme. Agitar en
forma horizontal y evitar que el medio sembrado llegue a la tapa del frasco.
Incubar las botellas en 35 0,5 C por 24 horas. Para el control de esterilidad del medio,
incubar un frasco de medio estril y continuar el procedimiento como si se tratara de una
muestra. El resultado debe ser negativo.
Para el caso de coliformes totales, observar el cambio en el color del medio. Si la botella es
positiva para coli-formes totales, verificar la presencia de E. coli con una lmpara de luz
ultravioleta de 366 manmetros de longitud de onda en un ambiente oscuro.
Sustancias
Positivo de coliformes
Sustrato totales Positivo De E. Coli Resultado Negativo
ONPG- Azul o
MUG Amarillo fluorescente Incoloro /No fluorescente
CPRG- Azul o
MUG Rojo o magenta fluorescente Amarillo/ No fluorescente
CONCLUSIONES
Es infaltable la evaluacin de caractersticas microbiolgicas como los coliformes totales y coliformes fecales
para muestras de agua, especialmente si su finalidad es el consumo humano, debido al riesgo que representa
para la salud humana la presencia de estos microorganismos.
Las tcnicas para determinar coliformes totales y coliformes fecales (E. coli) pueden ser cualitativas o
cuantitativas, lo que facilita la escogencia del mtodo a utilizar de acuerdo a las necesidades de las partes
interesadas.
La tcnica de filtracin por membrana es til para evaluar grandes volmenes de muestras o al realizar
diariamente muchas pruebas de coliformes y por lo general produce resultados numricos ms rpidamente
que el procedimiento de fermentacin en tubos mltiples, pero tiene limitaciones, en particular cuando se
prueba en aguas con alta turbidez o un gran nmero de bacterias no coliformes.
La tcnica de tubos mltiples (Nmero Ms Probable) es til para evaluar muestras de agua potable, as como
muestras de agua sin tratar con una alta densidad de partculas o coloreadas.
Los mtodos de presencia-ausencia y sustrato enzimtico son alternativas para la determinacin cualitativa
de coliformes totales y fecales. Son ms simples y econmicos que los mtodos cuantitativos.
REFERENCIAS
American Public Health Association; American Water Works Association; Water Envoriment Federation. (s.f.). Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater. New York: 22th Edition.
Aurazo de Zumaeta, M. (2004). Manual para anlisis bsicos de calidad del agua de bebida. Lima: Centro
Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Ambiente (CEPIS/OPS).
Carrillo Zapata, E. M., & Lozano Caicedo, A. M. (2008). Validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y
fecales en agua potable utilizando Agar Chromocult. Bogot D.C.
International Water And Health Alliances (IWHA). (s.f.). Obtenido de http://waterinternational.org/wp-
content/uploads/2012/05/IWHA-Spanish-Guide5-7-12
Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, Ministerio de la Proteccin Social. (2007). Resolucin 2115.
Organizacin Mundial de la Salud (OMS). (s.f.). Obtenido de http://www.who.int/topics/escherichia_coli_infections/es/
Paez Sanabria, L. J. (2008). Validacin secundaria del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de
coliformes totales y Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano. Bogot D.C.
The University of Arizona. (Marzo de 2014). La calidad del agua, E. coli y su salud. Obtenido de
https://extension.arizona.edu/sites/extension.arizona.edu/files/pubs/az1624s.pdf
Universidad de Murcia. (2010). Anlisis microbiolgico de aguas por filtracin. Obtenido de http://ocw.um.es/cc.-de-la-
salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas-1/practica-1-analisis-microbiologico-de-aguas-por
GRACIAS