Anlisis de Vitaminas

Integrantes:
Eduardo Aazco
Diego Guzmn
David Hugo
Jhonathan Ramrez
Profesora:
Patricia Garca Mora
 Importancia: determinar las
necesidades nutricionales de los
animales y humanos para valorar la
idoneidad de la dieta, conociendo
la composicin de los alimentos
El anlisis de vitaminas para establecer las ingestas
dietticas.

Las vitaminas son compuestos de Niveles insuficientes de vitaminas

peso molecular relativamente bajo. tienen como resultado
enfermedades carenciales por
Fuentes de nutrientes se necesitan ejemplo escorbuto y la pelagra; es
en pequeas cantidades para un la falta de cido ascrbico y de
metabolismo normal. niacina, respectivamente.

Los seres humanos no pueden

sintetizar la mayora de las vitaminas
y precisan obtenerlas de los
alimentos y suplementos
alimentarios.
Ensayos de las vitaminas
Involucrando seres humanos y
Bioensayos animales.

Haciendo uso de organismos

Ensayos microbiolgicos protozooicos, bacterias y
levaduras.

Incluyen mtodos como:

espectrofotomtricos,
Ensayos fsico-qumicos fluorimtricos, cromatogrficos,
enzimticos y radiomtricos.
 Debido a la
Muchos de los
sensibilidad de
mtodos oficiales
La seleccin de un algunas vitaminas a
presentados por la
ensayo depende de las condiciones como
AOAC International
una serie de factores, la luz, el oxgeno, el
estn limitados en su
los cuales incluyen: la pH y el calor; se
aceptabilidad a
exactitud, la deben tomar las
ciertas matrices
precisin, precauciones
como los
econmicos y el adecuadas durante
concentrados
volumen de muestras. todo el proceso de
vitamnicos, la leche
anlisis para evitar
o los cereales.
algn deterioro.
 El acido
ascrbico:
extraccin en
frio con cido
metafosfrico-
cido actico.

Las vitaminas A, Las vitaminas

E o D: extraccin Los B1 y B2:
con disolventes ebullicin o
orgnicos, mtodos extraccin con
saponificacin y
reextraccin con de cido en
autoclave, mas
disolventes
orgnicos.
extraccin tratamiento
enzimtico.

El anlisis de las
vitaminas liposolubles
puede requerir la
saponificacin,
La niacina:
extraccin en generalmente de un da
autoclave con para otro a
cido temperatura ambiente,
(productos o mediante una vasija
que no son
cereales) o de reflujo refrigerada
lcali por aire a 70C.
(cereales).
Los bioensayos se utilizan solamente para el
anlisis de las vitaminas B12 y D. Para la
vitamina D el mtodo normalizado de
referencia para el anlisis de los materiales
alimentarios; conocido como el ensayo LINE
TEST, basado en la calcificacin de los
huesos.

La determinacin de la vitamina D supone

estudios de carencia, as como el sacrificio
de los organismos de ensayo, est limitada a
los animales, ms que a los humanos.
 Potencia de la muestra
Periodo de ensayo
Periodo de deplecin
Preparacin de la muestra

La AOAC International Las ratas son adecuadas Es el intervalo de vida de Se determina la vitamina D
proporciona instrucciones para el agotamiento a la rata entre el ltimo da en la muestra por medio
para la preparacin de una edad 30 das, con del perodo de del ensayo LINE TEST del
diversas matrices para el un peso corporal 44g agotamiento y el octavo o teido extremo proximal
bioensayo. En algunos pero 60 g. La dieta el undcimo da despus. de la tibia o el extremo
casos, se hace uso de la raquitognica se Las ratas son alimentadas distal del radio o del
saponificacin. administra durante 18-25 con cantidades conocidas cbito.
das. y desconocidas de
vitamina D procedente de
los patrones y las muestras.
 La vitamina A
(El retinol)

FUNDAMENTO
Es sensible a la luz
ultravioleta, al aire, Se saponifica la muestra, se
a las temperaturas extrae la vitamina A al
altas y a la disolvente orgnico y se
humedad. concentra, y se determinan
los niveles de todo-trans-
retinol y de 13-cis-retinol, por
medio de la cromatografa
HPLC, sobre una columna de
slice.
Se emplea materiales de La CROMATOGRAFA
vidrio de color mbar, LQUIDA DE ALTA
nitrgeno o vaco, evitar RESOLUCIN (HPLC) se
temperaturas consideran los nicos LOS PUNTOS CRTICOS
excesivamente altas. Se mtodos aceptables para Se debe realizar llevar a cabo bajo
recomienda la adicin proporcionar medidas luz artificial atenuada.
de un antioxidante previo exactas de la actividad de
la vitamina A en alimentos Tener cuidado para evitar la
al procedimiento. oxidacin del retinol durante la
totalidad del procedimiento.
La evaporacin del disolvente
debera completarse bajo
nitrgeno y se aade hexadecano
para impedir la destruccin
durante la evaporacin del
disolvente.
Preparacin de la Extraccin del Parmetros para la
muestra. digerido cromatografa

Transferir 40 mL de Transferir en una pipeta

leche maternizada, 3mL dirigido a un tubo de
o de leche liquida, a centrfuga a 15mL y Columna: 15cm x 4,5 mm,
un matraz de aadir 2mL de agua. empaquetada con slice de
digestin de 100 mL. Extraiga con 7mL de 3mm
Aadir 10 mL de hexano-ter dietlico.
disolucin etanlica Repetir 2 veces con Fase mvil: Isocrtica,
de piragalol porciones de mL del heptano e isopropanol
(2%pirogalol en extractante. Juntar los
etanol del 95%) y extractos en un matraz
Deteccin: UV, 340 nm
saponifique con KOH aforado. Aada 1mL de
etanlico (10% KOH una disolucin de
en 90% etanol), a hexanodecano y diluya Flujo: 1-2 mL/minuto
temperatura con hexano hasta el
ambiente, durante aforo. Transfiera con una
18 horas, o a 70C pipeta 15mL del extracto
usando la vasija de diluido a un tubo de
reflujo. centrfuga y evapore bajo
nitrgeno. Disuelva el
residuo en 0,5mL de
heptano.
Vitamina B

Las vitaminas del grupo B forman un grupo de 8 vitaminas relacionadas

con el metabolismo celular. Las cuales son:

Vitamina Nombre Vitamina Nombre

B1 Tiamina B6 Piridoxina
B2 Riboflavina B7 Biotina
B3 Niacina B9 cido Flico
B5 cido Pantotnico B12 Cobalamina

Las vitaminas del grupo B que poseen anlisis qumico son la B1 y B2, el
resto del grupo se analiza por anlisis microbiolgico, es decir haciendo
uso de microorganismos
 Vitamina B1

La tiamina existe en la
naturaleza como tiamina,
monofosfato de tiamina,
difosfato de tiamina, trifosfato
de tiamina y unida a las
protenas. Las principales
fuentes de vitamina B1 son los
granos de los cereales,
cscara de arroz, germen de
cereales, levaduras, clara de
huevo, vegetales, frutas,
papas, huevos, leche, hgado y
carne.
 Vitamina B1
RESUMEN DE SU PROCESO
La tiamina es extrada por hidrlisis cida seguida por una etapa de desfosforilacin
enzimtica.
Debe tenerse cuidado que la preparacin enzimtica utilizada est funcionando.
El protocolo para la oxidacin a tiocromo debe ser seguido en forma precisa a fin
de obtener resultados reproducibles.
Debe llevarse un blanco durante el ensayo completo.
Los procedimientos por HPLC estn disponibles tanto para derivatizacin en
precolumna como tambin para derivatizacin postcolumna.
Vitamina B1
 Vitamina B2
La riboflavina se encuentra en los alimentos como
riboflavina libre o como riboflavina-5'-fosfato (FMN) y
como flavin adenina dinucletido (FAD).
Las principales fuentes de vitamina B2 son hgado,
rin, carne, pescado, leche, queso, huevos y
vegetales. La solubilidad de la riboflavina en el agua
es ms bien deficiente (aprox. 7 , mg/100 ml) pero en
lcali diluido es fcilmente soluble.
 Vitamina B2
Procedimiento de anlisis de la Riboflavina mediante la fluorescencia

Preparacin de la muestra
Pesar la muestra homogeneizada, aada HCl 0,1 N, mezcle y a continuacin someta la muestra al
autoclave, durante 30 minutos, a 121C, y enfre. Precipite las sustancias interferentes por medio de un
ajuste de pH a 6,0, seguido inmediatamente por un reajuste del pH 4,5; diluya hasta el aforo con H2O y
filtre.

Oxidacin de los materiales que interfieren

Introducir 10 ml de filtrado en cada uno de los cuatro tubos. Adicione 10ml de H2O a dos de los tubos y
aada 1 ml de disolucin patrn (0,5 g de Riboflavina/mL), a cada uno de los dos tubos restantes.
A cada uno de los tubos, de uno en uno, aada 1ml de HOAc glacial, seguido por 0,5 mL de KMNO4
al 3%, deje reposar durante dos minutos; a continuacin, adicione 0,5 mL de H2O2 al 3% y agite bien.

Medida de la fluorescencia
Mida la fluorescencia E=440, E=565 nm. En primer lugar, tome la lectura de los extractos de las
muestras conteniendo H2O; a continuacin, aada 20 mg de Na2S2O4, mezcle y vuelva a
tomar la lectura. Seguidamente, tome la lectura. Seguidamente, tome la lectura de las
muestras patrones
 Vitamina B2
RESUMEN DE SU PROCESO
La vitamina B2 se extrae de la matriz alimentaria mediante hidrlisis cida seguida
por una etapa de desfosforilacin enzimtica.
Debe tenerse cuidado que funcione la preparacin enzimtica a utilizar. Esto puede
hacerse inyectando estndar de FMN en la lnea de HPLC y controlando la muestra
tratada para FMN residual.
La riboflavina liberada debera protegerse de la luz.
Se logra la mejor cuantificacin y separacin utilizando HPLC de fase reversa.
El modo de deteccin es preferentemente realizado por fluorescencia dado que
ste es ms selectivo.
Vitamina B2
Vitamina
Mtodos para el anlisis de la vitamina C

Mtodo volumtrico del 2,6-dicloroindofenol

Mtodo microfluorimtrico

Mtodo de cromatografa lquida de alta

eficacia
Mtodo volumtrico del 2,6-dicloroindofenol

El a. L-ascrbico se oxida al a. L-dehidroascrbico por el tinte indicador.

En presencia de cantidades significativas de hierro o cobre , es aconsejable incluir un agente
quelante, a. etilenodiaminotetraacetico.
Cuando en las muestras coloreadas el punto final se hace imposible verlo, se debe utilizar un
espectrofotmetro con la longitud de onda fijada a 545 nm.
Mtodo:
Se pesa y extrae mediante la homogeneizacin de la muestra en una disolucin de cido
metafosfrico- cido actico.
Se filtra el extracto de la muestra y se diluye aproximadamente hasta una concentracin final
de 10-100 mg de cido ascrbico/100 mL.
Se pesa 50 mg de cido L-ascrbico y diluya a 100 mL con disolucin extractante de cido
metafosfrico- cido actico.
Valore tres duplicados de cada uno, con una disolucin de dicloroindofenol hasta un punto
final de color rosa que persista durante 10 segundos.
Resultados del mtodo

mg de cido asrbico/g o mL de muestra = C x V x (DF/WT)

Donde:
C = mg de cido ascrbico/mL de tinte
V = mL de tinte consumidos en la valoracin de la muestra diluida
DF = factor de dilucin
WT = peso de la muestra, g
Mtodo microfluorimtrico
Se miden ambos, el cido ascrbico y el cido dehidroascrbico.
Despues de la oxidacin del cido ascrbico, forma un compuesto quinoxalnico
fluorescente, tras su reaccin con la o-fenilenodiamina.
Para compensar la presencia de materia extraa interfiriente, es necesario desarrollar blancos
utilizando cido brico, antes de la adicin de la disolucin de la diamina.

Mtodo:
Prepare la muestra y extrigala mediante la homogeneizacin en una disolucin de cido
metafosfrico- cido actico.
Aada 2 g de Norit lavado a los cidos a 100 ml de cada disolucin, agite enrgicamente y
filtre.
Transfiera 5 mL de cada uno de los filtrados a sendos matraces aforados de 100 mL,
conteniendo 5 mL de una disolucin de H3BO 3-NaOAc.
Deje reposar 15 minutos, agitando ocasionalmente. Transfiera 2 mL de cada disolucin a
sendos tres tubos.
 Mtodo microfluorimtrico
Mtodo:
Transfiera 5 mL de cada una de las disoluciones a sendos matraces aforados de 100 mL, que
contengan cada uno 5 mL de NaOAc trihidrato al 50% y 27 mL de H2O, diluya con agua hasta
enrasar.
Transfiera 2 mL de la disolucin del patrn o de la muestra a cada uno de dos conjuntos de
tres tubos para la fluorescencia.
Aada 5 mL de una disolucin acousa de o-fenilenodiamina a cada uno de los tubos, agite
usando un agitador-vibrador y deje reposar durante 35 minutos a temperatura ambiente.
Resultados del mtodo

mg de cido ascrbico/g o mL = [(A-B)/(C-D)] x S x DF/WT

Donde:
A y C = fluorescencia de la muestra y el patrn, respectivamente.
B y D = fluorescencia de los blancos de la muestra y el patrn, respectivamente.
S = concentracin del patrn en mg/mL.
DF = factor de dilucin
WT = peso de la muestra, g
Mtodo de cromatografa liquida de alta eficacia
En aos recientes, diversos investigadores han publicado procedimientos que utilizan HPLC
para separar y cuantificar cido ascrbico y/o cido dehidroascrbico.
Este procedimiento de ensayo permite la determinacin simultnea de cido ascrbico y
cido eritrbico
Se lo a utilizado para determinar cido ascrbico en carne, productos crnicos, alimentos
procesados, alimentos enriquecidos, verduras, frutas, leche y bebidas.

Mtodo:
El material (1-5 g) es extrado con 25-50 ml de cido metafosfrico 0,5% que contiene
ditiotreitol 0,2% (DTT) utilizando un homogenizador o mediante agitacin.
Despus de la centrifugacin, el extracto es diluido con buffer acetato pH 4,8 que contiene
DTT 0,2%, se filtra usando un filtro de 0,45 m
Al final se inyecta en el HPLC.
Vitamina
Mtodos para el anlisis de la vitamina D

Saponificacin y extraccin

Evaporacin y dilucin

Mtodo espectrofotomtrico
Saponificacin y extraccin

Si se va a determinar la vitamina D3, se agrega D2 como estndar interno o viceversa.

La vitamina D2 y la vitamina D3 son extradas de los alimentos mediante saponificacin
utilizando una solucin alcohlica de hidrxido de potasio seguida de una extraccin del
solvente.
La determinacin de vitamina D2 y D3 en una solucin apropiada del extracto de la muestra
se realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa
analtica.
La cromatografa se monitorea por UV y se logra la identificacin de los picos de acuerdo a
los tiempos de retencin y la cuantificacin se realiza por el mtodo de estndar interno
utilizando las reas o las alturas de los picos.
 Saponificacin y extraccin
Mtodo:
De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una
mezcla de etanol o metanol, agua, un antioxidante
El antioxidante debera agregarse a la muestra antes de la adicin de la solucin de
hidrxido de potasio necesaria para la saponificacin.
Si ha de determinarse vitamina D3, se pipetea una cantidad apropiada de estndar de
vitamina D2 en la solucin alcohlica dentro del frasco de saponificacin.
La cantidad de estndar interno de vitamina D2 agregada deber ser similar a la cantidad de
vitamina D3 esperada en la muestra y viceversa.
El tiempo normal de saponificacin es de 20-45 minutos con temperaturas que fluctan de 80
a 100C (reflujo).
 Evaporacin y dilucin
Mtodo:
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando
un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C.
Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio,
o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin de
fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil del sistema HPLC
semipreparativo u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de obtener una
concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la columna de HPLC.
Mtodo espectrofotometrico
Mezclar completamente el producto lcteo, sacudiendo el recipiente que lo contiene varias
veces, hasta que la muestra est homognea.
Si se forma grumos de crema y stos no se dispersan, calentar la muestra en bao de agua, a
35 40 C ; mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partcula de crema adherida al
recipiente y enfriar rpidamente entre 18 - 20C .
No deben quedar partculas blancas o grumos adheridos a las paredes del recipiente.

Mtodo
Se debe hacer por duplicado, pesar 0,1 mg, 2 gramos de muestra y transferirla a un
Erlenmeyer
Agregar 50 cm3 de etanol, 14 cm3 de glicerina y 20 cm3 de la solucin de hidrxido de
potasio. Colocar en el condensador de reflujo y calentar a ebullicin durante 30 minutos,
agitando ocasionalmente.
Aadir 110 cm3 de agua, dejar en reposo por 10 minutos, agitando ocasionalmente. Enfriar y
filtrar en un frasco volumtrico de 250 cm3. Lavar el Erlenmeyer y el filtro con etanol, hacer a
la marca con el mismo solvente y mezclar.
 Mtodo espectrofotometrico
Mtodo:
Tomar una alcuota de 5 cm3 y colocarlo en una ampolla de separacin de 125 cm3
y extraer con cinco volmenes sucesivos del ter de petrleo, usando en cada extraccin 5
cm3 del reactivo.
Recibir los excedentes en un frasco volumtrico de 25 cm3 y llevar a volumen con ter de
petrleo.
Tomar por duplicado una alcuota de 5 cm3 y evaporar a sequedad en corriente de
nitrgeno. Disolver el residuo en 1 cm3 de cloroformo.
Agregar 9 cm3 de la solucin de tricloruro de antimonio, mezclar rpidamente y transferir a la
clula ptica de 10 mm. Despus de 1,5 a 2 minutos que haya sido agregada la solucin de
tricloruro de antimonio, medir la absorbancia en una longitud de onda de 500 nm y 550 nm
en el espectrofotmetro.
Repetir el mismo procedimiento por duplicado, usando 1 cm3 de la solucin estndar de
calciferol o vitamina " D " en lugar de la muestra, y usar el mismo procedimiento que para la
muestra.
Debe realizarse un ensayo en blanco, usando cloroformo, el mismo material, reactivos,
cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que para la muestra.
Resultados del mtodo

V.D = A1 x C x d / A2 x m x 1000
Donde:
V.D = contenido de calciferol en miligramos
A2 = Promedio de lectura de las 2 absorciones en la solucin estndard
A1 = Promedio de lectura de las 2 absorciones en la solucin de la muestra
C = Contenido de calciferol (vitamina D) de la solucin estndar
d = Dilucin total usada en hacer la solucin de la muestra en cm3
m = masa de la muestra analizada en g
Vitamina
Mtodos para el anlisis de la vitamina E

Cromatografa HPLC

Saponificacin y extraccin
Cromatografa HPLC
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa)
para la cuantificacin de los tocoferoles. El sistema de fase normal tiene claras ventajas dado
que todos los vitmeros son separados mientras que los sistemas de fase reversa no separan
-tocoferol de y-tocoferol.
MTODO:
Para productos alimentarios en general:
Aada a la muestra 10 mL de pirogalol al 6% (m/v) en etanol, mezcle e inunde con N2
Calentar a 70C, durante 10 minutos, con sonicacin.
Aada 2 mL de disolucin de KOH al 60%. Mezcle en inunde con N2
Cromatografa HPLC
MTODO:
Para productos alimentarios en general (continuacin):
Digiera durante 30 minutos, a 70C.
Someta a Sonicacin durante 5 minutos.
Enfre a temperatura ambiente y aada cloruro de sodio y agua.
Extraiga tres veces con hexano (al 0,1% de BHT).
Junte los extractos de hexano, aada 0,5 g de MgSO4 y mezcle.
Filtre a travs de un aparato de filtracin Millipore (tamao de poro 0,45 m)
Diluya con hexano hasta enrasar.
Inyecte 20 L.
Cromatografa HPLC
MTODO:
Margarina y los untos de aceites vegetales:
Aada 40 mL de hexano (al 0,1% de BHT) a una muestra de 10g y mezcle.
Aada 3g de MgSO4, mezcle y deje reposar 2 horas.
Filtre y diluya el filtrado combinado con hexano (0,1%) hasta enrasar.
Inyecte 20 L.
 Cromatografa HPLC, Parmetros

Columna Hibar RT, Lichrosorb Si60 5 m, 25,0 cm x 4,6 mm

Fase Mvil isopropanol al 0,9% en hexano

Flujo 1 mL/minuto

Detector de fluorescencia. Ex = 290 nm, Em = 330 nm

Saponificacin y extraccin
El procedimiento ms comn para la determinacin de tocoferoles incluye la saponificacin
alcalina de las muestras seguida por la extraccin del material no saponificable con un
solvente orgnico apropiado. Cualquier ster de a-tocoferol que pueda haberse agregado
como un suplemento a los alimentos ser convertido a t-tocoferol por este procedimiento.

MTODO:
Se saponifica 2-10 g de la muestra preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de
etanol o metanol, agua, un antioxidante tal como el cido ascrbico, hidroquinona, piro-
galol o BHT e hidrxido de potasio acuoso.
Los tocoferoles son muy sensibles al oxgeno en un ambiente alcalino. Por lo tanto, el alcohol y
el antioxidante deberan agregarse a la muestra antes de la adicin de la solucin de
hidrxido de potasio necesario para la saponificacin y tiene que tenerse cuidado en
remover todo el oxgeno del recipiente de reaccin.
A continuacin se muestra un ejemplo de la proporcin de estos reactivos.
Proporcin de reactivos para saponificacin
Peso de la Alcohol Acido ascrbico Hidrxido de potasio
muestra

2-5 g 50 ml (metanol) 0,25 g 5 ml (50%)

10 g 150ml (etanol) 1,0 g 50 ml (60%)

5-10 g 100ml (etanol) 1,0 g + 0,04 g 12 g + 20 ml de agua

Na2S
Vitamina
 Vitamina K
La vitamina K de efecto antihemorrgico, que tiene un rol importante en regular la coagulacin
sangunea se encuentra en una serie de formas; qumicamente las molculas son derivados del
2-metil-l,4-naoquinona que tiene una cadena lateral en la posicin 3. En el grupo de la vitamina
Kj la cadena lateral tiene slo un enlace doble, mientras que en el otro grupo de la vitamina K3,
los dobles enlaces de la vitamina K3 se repiten regularmente en la cadena lateral. El miembro
ms importante del grupo es el compuesto dentro de la serie K1 con 20 tomos de carbono en la
cadena lateral, generalmente conocido como vitamina K1.
 Digestin enzimtica y extraccin
Se agrega fenilacetato de colesterol como estndar interno y la vitamina es extrada con hexano.
La determinacin de la vitamina K1 en la solucin del extracto de la muestra se realiza mediante HPLC
semi-preparativa de fase normal seguida por HPLC analtico de fase reversa. La deteccin de la
vitamina K se realiza mediante UV a 269 nm y se logra la identificacin del pico sobre la base de
tiempos de retencin.
La cuantificacin se realiza mediante el mtodo de estndar interno utilizando las reas o alturas del
pico.
Tres gramos de la muestra (frmula infantil o leche en polvo) o 15,0 g de frmula "lista para usar" se
suspenden en agua, buffer fosfato y 1 g de lipasa. La mezcla es incubada durante 120 min. a 37C.
Se agrega 10 ml de etanol, el estndar interno y 1 g de carbonato de potasio y se extrae la vitamina 2
veces con 15 ml de nhexano.
 Evaporacin y dilucin
Los extractos combinados son concentrados utilizando un evaporador rotatorio bajo vaco
parcial y a una temperatura que no exceda 40C.
Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o
destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto en un pequeo volumen de n-hexano (1,5-2,0 ml).
 HPLC
Sistema semipreparativo
Un estndar de vitamina K1 es cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y las
condiciones optimizadas de tal manera de obtener un tiempo de retencin reproducible para el
pico de vitamina K1 y el pico de fenilacetato de colesterol en el rango de 2,0-4,5 minutos
Sistema HPLC analtico
Una mezcla de estndar de vitamina K1 y fenilacetato de colesterol debe ser cromatografada
en el sistema HPLC analtico y las condiciones cromatogrficas ajustadas hasta que se obtenga
una resolucin completa de los compuestos de inters.
Condiciones y cuantificacin de HPLC
Una alcuota del extracto concentrado de la muestra se inyecta dentro del sistema HPLC
semipreparativo y la fraccin que contiene la vitamina K1 es recolectada va corte de bandas.
La ventana de tiempo para el corte de bandas debe haber sido previamente determinada
utilizando una mezcla estndar de vitamina K1 y deber ser lo ms angosta posible.