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Chromatographie Quantitative

Mr. BOUDIS 2005


Introduction :
Utilises tout dabord comme mthodes sparatives de
choix, les mthodes chromatographiques notamment la
chromatographie liquide (CHLP) et, la chromatographie
en phase gazeuse sont devenues des techniques
danalyse quantitative prcises et fiables.
Aujourdhui lintrt de lanalyse quantitative
surclasse largement les applications qualitatives.

La chromatographie quantitative est base sur la


reproductibilit des sparations et, sur la relation entre
deux paramtres :
La masse du compos injecte dans le chromagraphe.
Lair du pic correspondant (ou parfois la hauteur du pic
lorsquil est trs troit).
Dans des conditions danalyses contrles ces deux
paramtres varient linairement avec la concentration
du solut.
1- Relation de base :
La plupart des dtecteurs utiliss en analyse
chromatographique sont des dtecteurs diffrentiels
qui rpondent aux modifications de concentrations du
solut dans leffluent et , mesurent la variation de
grandeurs proportionnelles la concentration des
soluts dans leffluent ( absorbance, fluorescence,...).

Laire du pic obtenu est lie la quantit de solut ayant


travers le dtecteur par la relation :
mi = Ki . Ai
Le problme de lanalyse quantitative va donc se rduire
la dtermination de deux grandeurs :
- Laire dun pic (A).
- Le facteur de proportionnalit relatif ce pic (K).

2- Mesure de laire des pics :


Lvaluation de la surface des pics peut tre ralise par
diffrentes mthodes. Certaines de ces mthodes , dites
mthodes manuelles permettent daccder une valeur
approche de cette aire par des procd sinples.

Aujourdhui ces mthodes qui concernent les mthodes


gomtriques, pondrale et la planimtrie, ont perdu de
leur importance au profit de systmes dintgration
automatiques. Elles seront brivement dcrites.
2-1- Mthodes manuelles

2-1-1- Mthodes gomtriques :


Leur mise en oeuvre ncessite lobtention des pics
symtrique, dallure gaussienne.
Si on considre quun pic est exactement une courbe de
Gausse, que sa largeur la base est trs infrieur sa
hauteur H, sa surface peut tre assimile est donn par
la relation :
S = 0,627 H .

2-1-2 Mthode pondrale

2-2 Planimtrie
2-3 Mthodes automatiques :
Ce sont actuellement plus utilises pour la
dtermination des aires des pics. Ces appareils
visualisent et affichent les surfaces intgres.
Lintgration automatique prsente lavantage :

- dliminer le facteur humain.

- de permettre une excellente approche de laire relle.

- une excellente reproductibilit sur lvaluation des aires.

- une rapidit dexcution apprciable


3- Principales mthodes de dtermination des
concentrations

3-1- Mthode de ltalonnage externe (STANDARD


EXTERNE) :
Principe :

Mthode base sur la comparaison de deux


chromatogrammes (talonnage et dosage ) obtenus
successivement et dans des conditions
chromatographiques, strictement identiques ( maintient
du coefficient de proportionnalit Ki une valeur
constante).
a- Chromatogramme de rfrence :
On injecte un volume V donn dune solution de
rfrence contenant le compos M doser une
concentration connue CRf , on mesure laire du pic ARf .

CRf . V = mRf = KRf . ARf

b - Chromatogramme du dosage :
On injecte un volume V rigoureusement identique au
prcdent de la solution doser du compos M de
concentration inconnue CEch .
On mesure laire du pic AEch.

CEch . V = mEch = KEch . AEch


c - Calcul de la concentration inconnue :
CEch . V = K . AEch
CRf . V = K . ARf
AEch
Dou : CEch = CRf .
ARf
d- Exigences de la mthode :
- Les concentrations des solutions de rfrences et de
dosage doivent tre du mme ordre de grandeur ( si un
seul point de mesure).
- La reproductibilit des volumes dinjection doit tre
excellente.
- Les conditions chromatographiques doivent rester
strictement inchanges entre les injections ( lirrgularit
des volumes injects peut tre minimise par lutilisation
dinjecteur vannes ou dinjecteur automatique).
e- Intrt de la mthode :

- Elle ne dpend pas de la dtermination pralable de K.


- Elle constitue lapproche la plus simple de lanalyse
quantitative en chromatographie.

3-2- Mthode de ltalonnage interne :


3-2-1- Principe :
La mthode est base sur la comparaison des
aires des pics des produits quantifier avec laire dun
compos de rfrence ou talon interne introduit une
concentration connue dans lchantillon analyser et
dans une solution de rfrence.
3-2-2- Principaux critres de choix de ltalon
interne :

Doit tre de puret connue, proche chimiquement et


physiquement du compos doser ( volatilit et polarit
voisines ,proprits dlution comparables) .

Doit tre inerte vis vis de la phase luante et des


composs de lchantillon.

Ne doit interfrer avec aucun des constituants


prsents dans lchantillon.

Son pic dlution doit tre bien rsolu par rapport tous
ceux qui forment le chromatogramme de lchantillon.
Ses caractristiques chromatographiques, en particulier
son temps de rtention doit tre le plus proche possible
de celui de la substance doser.

Son coefficient de rponse doit tre du mme ordre de


grandeur que celui du produit doser.

Son extraction, si ncessaire, partir dun milieu


complexe ( milieu biologique en particulier) doit se faire
dans les mmes conditions que celles de la substance
doser (solvant, pH)
3-2-3- Mise en oeuvre de la mthode :
Nous supposerons que lchantillon analyser est
dsign par 1 et ltalon interne dsign par E.

a- Chromatographie dune solution de rfrence :


Calcul des coefficients de rponse relatifs :
Premire tape :

* Prparation dune solution de rfrence de


concentration connue avec prcision C1 en 1, et CE en
talon interne.
* Injection dun volume connu.
* Dtermination sur le chromatogramme des aires A1, et
AE des pics dlution des composs 1 et ltalon. On
peut crire :
C1.V = m1 = K1 . A1
C1.V m1 K1 . A1
= =
CE.V mE KE . AE
CE.V = mE = KE . AE

C1 . AE
K1/E =
CE . A1

b-Chromatographie de lchantillon :
Deuxime tape :
On chromatographie un volume quelconque de lchantillon
analyser dans lequel on ajoute une quantit connue CE
de ltalon interne E. Soient A1 et AE les aires des pics
dlution mesures sur le nouveau chromatogramme.
En adoptant le mme raisonnement que celui de la
premire tape nous pouvons crire :

A1
C1 = CE . K1/E .
AE

4-2-4- Intrt de la mthode :


- Permet de saffranchir de lerreur commise sur le
volume de linjection.
- Permet dobtenir des rsultats reproductible et
prcis.
4-3- Mthode de normalisation interne :
Mthode rserve aux mlanges dont tous les soluts
ont t lus et les pics spars.
On considre que les coefficients de rponses sont
connue dans les conditions exprimentales considres.

Exemple : Soit un mlange de trois (3) composs 1, 2 et 3


de masse m1 , m2 et m3 donnant trois pics bien spars
daires respectives A1, A2 et A3 .
On a les relations :
m1 = K1 . A1
m2 = K2 . A2
m3 = K3 . A3
K1 , K2 et K3 : les coefficients de rponse respectifs.
On dduit : K1 .A1 + K2 . A2 + K3 .A3 = m1 + m2 + m3
K1.A1
m 1% = . 100

K1A1 + K2A2 + K3A3

Remarque :
- Les coefficients de rfrences doivent avoir t
dtermins dans les mmes conditions que lanalyse.
- Tous les composes du mlange doivent avoir t
lus avec une bonne rsolution.
- La mthode ne permet pas lanalyse dun mlange
inconnu.
- La mthode est surtout utilise en chromatographie en
phase gazeuse
Lorsque les coefficients de proportionnalit ne sont pas
connues leur dtermination pralable est faite partir
dune solution synthtique (solution de rfrence )
contenant tous les composes du mlange. On choisit
un des composes comme substance de normalisation
interne afin de dterminer les coefficients de rponse
relatif.

Conclusion :
Les trois principales mthodes dcrites sont la
base pratiquement de tout les dosages
chromatographiques.
- La mthode de ltalonnage externe :exige une
excellente reproductibilit des volumes injects,
ncessaite linvariance des conditions
chromatographiques pendant les deux tapes de
lanalyse.
- Les erreurs lies limprcision sur le volume
dchantillon inject ont t rduites grce lutilisation
de vanne boucle dchantillonnage et dinjecteur
automatique.
- La mthode de ltalonnage interne : est une mthode
gnrale qui offre une meilleure prcision. Les erreurs
introduites par linjection de lchantillon et le risque de
variation des conditions chromatographiques sont
minimises.
- Elle exige nanmoins la recherche et le bon choix de
ltalon interne.
- La mthode de la normalisation interne : cest
une mthode dapproche rserve aux
mlanges parfaitement identifis dont tous les
constituants apparaissent sur le
chromatogramme.