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Parche de micro-agujas en forma de bala, auto-adherente, para

administracin transdrmica de insulina


Los frmacos protenicos se administran comnmente por va subcutnea
para aumentar la biodisponibilidad y evitar la degradacin enzimtica.

Una alternativa es la entrega de protenas por va cutnea, esta va podra


proporcionar un suministro de protenas cmodo de una manera
mnimamente invasiva.

Debido a que las protenas son molculas hidroflicas grandes, la


permeacin pasiva esta impedida por el estrato corneo (SC), la barrera
ms externa de la piel compuesta de queratinocitos muertos.

Las tcnicas de micro-agujas (MN) ofrecen un mtodo atractivo para la


liberacin de frmacos protenicos creando micro-canales a travs de la
piel; Estos canales ayudan en el transporte percutneo de frmacos

Debido a que son de tamao micromtrico, pueden aplicarse a la piel sin


causar dolor y con un traumatismo mnimo reduciendo el riesgo de
infeccin.
para va transdrmica para frmacos Solidos: slidos revestidos con frmaco tiles para administrar
macromolculas. Entrega rpida de la dosis deseada en la piel despus de la
insercin. La cantidad de frmaco que se puede recubrir sobre la superficie
de MNs es limitada
Tipos de MN

protenicos

Huecos: permiten la infusin de formulaciones de protenas lquidas, estn


diseados para ser de accin rpida mediante la entrega de protenas
intactas en una solucin tamponada en capas ms profundas de la piel

Disolubles: cargadas con frmaco se preparan utilizando procesos de


micro-molding o de alojamiento con soluciones de frmaco/polmero
El frmaco encapsulado se libera rpidamente de los MN despus del contacto con el fluido
intersticial despus de la insercin en la piel, es por esto que es difcil conseguir la administracin
sotenida y de manera controlada.
En un intento por lograr la liberacin prolongada de frmacos protenicos, se realizaron MNs
reticulados, preparados mediante reticulacin qumica o fsica de polmeros hidrfilos.
Los MNs reticulados formados de hidrogeles, propician un canal de transporte para los frmacos
encapsulados en el MN o incorporados en un deposito de frmaco unido a la capa de MN
formadora de hidrogel, logrando as su liberacin sostenida del frmaco transportndose a travs de
la red polimrica.
La importancia de la correcta seleccin de reticulantes qumicos durante el proceso de
encapsulacin de frmacos protenicos, para evitar el impacto de la bioactividad de la protena que
puede disminuir por la sensibilidad de la estructura terciaria.
Los sistemas de deposito MN formadores de hidrogel pueden suministrar frmacos desde el deposito a
travs de una red hinchada, sin embargo, la cintica de liberacin del frmaco podra afectarse por
el nivel de hidratacin de la capa de MN formadora de hidrogel.
Fig. 1a, el MN de doble capa con los frmacos cargados en punta hinchable, consigue la adhesin
mediante un enclavamiento mecanico absorbiendo fluidos corporales despus de su insercin en la
piel propiciando canales de difusin para liberar el frmaco cargado en la punta.
El presente trabajo demostr que el diseo MN fue eficaz para lograr una adherencia fiable a la piel
animal, incluso en condiciones dinmicas. Mediante el uso de las propiedades reversibles de
hinchamiento/desintegracin de las puntas MN hinchables, los parches de MN cargados de insulina
muestran el potencial para regular los niveles de glucosa en sangre en un modelo preclnico que
podra proporcionar un tratamiento no invasivo de la diabetes tipo 1.
Imgenes del parche de doble capa MN.
(A)Ilustracin esquemtica de un MN que se puede modificar su forma por la
sensibilidad al agua para una adhesin (enclavamiento) con la piel y liberar el
frmaco mediante la difusin pasiva.
(B) Fotografas del parche de MN de doble capa con forma de bala con una matriz
de 10 x 10 en una placa de 1cm2. La matriz MN mostr buena uniformidad
estructural sealado por las flechas con asteriscos.
(C) imgenes SEM para una vista en seccin transversal que muestra una estructura
MN de capa doble que consiste en una PS-PAA externa y una capa PS interna.
2.1. Fabricacin de parches en forma de bala de doble capa MN
Obtencin de polystyrene-block-poly(acrylic acid) (PS-PAA) que se empleo para las puntas
hinchables de la mas MN
Se coloco un volumen determinado de PS-PAA en un molde de PDMN
El secado del disolvente provoc la formacin de una pelcula gruesa en la regin de la punta de la
cavidad en forma de bala y una pelcula delgada sobre el resto del molde.
Para formar el ncleo interno MN y la capa de soporte del parche MN, se colocaron 0,15 g de
grnulos de PS sobre la capa PS-PAA seca, se fundieron a 180C y luego se rellenaron en cavidades.
Despus de enfriar a temperatura ambiente, las matrices de MN de doble capa se retiraron del
molde.
Para crear parches PS MN no hinchables, se fundieron grnulos de PS de 0,15 g sobre los moldes. La
morfologa de los parches MN se examin utilizando un microscopio ptico y un microscopio
electrnico de barrido.
2.2. Cambio de forma de MNs por respuesta al agua
Se cort una hilera de MN de un parche, se insert en el hidrogel multicapa y se registr el cambio
de forma de los MN causados por el hinchamiento usando un microscopio invertido. Despus de
alcanzar su estado mximo hinchado, la matriz MN se retir del hidrogel y se registr el
comportamiento de deshabituacin del MN hinchado a medida que se secaba a 25C durante 30
min.

Para la caracterizacin del poro formado PS-PAA con un espesor de 300 m. Despus de hincharse
en agua desionizada (DI), la pelcula de PS-PAA hinchada se liofiliz durante y se cort para
observar la estructura interna de poro usando FE-SEM. El tamao de poro en la pelcula liofilizada se
caracteriz por el uso de software de anlisis de imgenes (ImageJ).
Resultado
Despus de la insercin en el hidrogel, el volumen de las puntas hinchables aument rpidamente y
el cambio de volumen se produjo principalmente en la regin de la punta.
El MN hinchado form una estructura en forma de punta de flecha, adecuada para enclavamiento
mecnico con tejido.
El MN hinchado se deshidrat inmediatamente en condiciones ambientales despus de que se retir
del hidrogel y recuper completamente su forma original de bala en 20 minutos (figura 2b). Este
comportamiento de hinchamiento/ des-hinchamiento fue reversible durante varios ciclos sin ningn
cambio dimensional en los MN.
La respuesta al agua reversible fue ventajosa para cargar frmacos, incluidas protenas, en las
puntas de MN hinchables y para penetrar tejido de la piel debido a la recuperacin de la forma
original y la rigidez de los MN despus del proceso de secado. De este modo, se puede conseguir un
suministro transdrmico eficiente de los frmacos cargados en la piel.
2.3. Experimentos de adhesin con tejido cutneo
Para medir la fuerza de adhesin de los parches, se obtuvieron pieles de rata frescas despus de la
necropsia, seguido de la eliminacin de pelo de la piel. La piel de rata se almacen congelada.
Se realizaron ensayos de adhesin normal para muestras con un rea de 1 cm2 usando un testador
mecnico.
Los tejidos cutneos seccionados se fijaron al dispositivo de ensayo opuesto y se fijaron al agarre
inferior del probador mecnico. Las muestras de ensayo se comprimieron utilizando 10 N de precarga
a 100 mm min-1 y se mantuvieron en posicin durante 10 min. Las muestras se desplazaron a una
velocidad de 1 mm min-1 y se registr la fuerza. La fuerza de compresin de 10 N se seleccion
cuidadosamente como una fuerza de insercin mnima para asegurar las puntas hinchables se
pueden insertar completamente en la piel
Resultados
Debido a que el enclavamiento mecnico de MNs hinchables es altamente dependiente del
hinchamiento selectivo de las puntas por la absorcin de fluidos corporales, se investigo el efecto de
la altura de la punta hinchable sobre la adhesin.
Los parches MN con alturas de punta hinchables al 60% mostraron incrementos en la fuerza de
adhesin con alargamiento durante la etapa de extraccin. Mostr perfiles de adherencia agudos,
alcanzando una resistencia de adhesin mxima en menos tiempo.
La adhesin de los MNs hinchables basados en el enclavamiento mecnico era altamente
dependiente de las propiedades anisotrpicas de la piel compuesta por la epidermis y la dermis.
Despus de la penetracin en la piel, el volumen de la punta hinchable se expandi por la entrada
de fluido y luego la punta hinchada se atasc firmemente debajo de una capa de SC rgida y
densa.
Los parches MN hinchables en forma de bala mostraron un rendimiento adhesivo ms fiable y
aumentado en comparacin con los parches MN en forma de cono con el mismo dimetro de base
y altura.
2.4. Experimentos in vitro de liberacin de insulina
Para probar la liberacin de insulina de los parches de MN hinchables, se dej caer 0,1 mL de
solucin Humulin sobre los parches MN hinchables y se sec lentamente para encapsular
totalmente la insulina en los parches a 25C durante 12 h. Los parches MN se secaron
completamente en una cmara de vaco durante 6 h.
Para los parches de MN revestidos con insulina, la insulina se dej caer y se sec sobre parches no
hinchables de la misma manera que se us para preparar los parches de MN hinchables.
Para examinar la cintica de liberacin de la insulina de los parches MN, los parches hinchables
cargados de insulina y los parches revestidos con insulina se sumergieron en un bao (20 ml) de PBS
a 37C. A intervalos predeterminados (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 y 12 h), se extrajo 1 ml de la solucin del
bao y se reemplaz con un volumen igual de PBS fresco. La cantidad de insulina liberada se
determin usando un ensayo de protena de Bradford (BPA). Brevemente, el reactivo de Bradford y
las muestras de ensayo se mezclaron suavemente en una relacin 1: 1 (v / v) en un tubo de 1,5 ml y
se incubaron a 25C durante 2 min. La absorbancia se midi a 595 nm usando un espectrofotmetro
UV / VIS. La integridad estructural de la insulina liberada se determin usando un kit de insulina
humana ELISA.
Resultado
El parche MN revestido exhibi un efecto de rfaga, liberando> 90% de la insulina recubierta dentro
de 30 min.
La insulina cargada en los MNs hinchables se liber a una velocidad constante sin liberacin de
rafaga durante las 6 h iniciales y se liber un total de hasta 241 20 g (6,04 0,52 U) durante 12 h,
correspondiente a aproximadamente 60% de la cantidad total de insulina cargada.
Debido a que la insulina se encapsul en su mayor parte en la capa hinchable del MN y se liber de
la red de polmero hinchada, se consigui una liberacin controlada de insulina.
La integridad estructural de la insulina liberada se mantuvo sobre el 70% como se estim
comparando la relacin de los valores de ELISA a BPA. Este resultado sugiri que el proceso de carga
minimiz la prdida del efecto teraputico de la protena por cambio conformacional, aunque
podra ser difcil lograr una liberacin completa de protena cargada debido a una posible
interaccin con el hinchado Polmero.
Asumiendo una distribucin igual de la insulina despus de la carga sobre toda la capa de PS-PAA
hinchable, estimamos que aproximadamente el 30% de la insulina en la solucin de carga estara
encapsulada en las puntas de los parches MN mientras Otro 70% de la insulina se cargara en la capa
base
2.5. Evaluacin ex vivo de la penetracin de insulina marcada
con FITC
La administracin de insulina al tejido de la piel de rata se evalu usando el parche de MN cargado
con insulina marcada con FITC (isotiocianato de fluorescena). Se dej caer 0,1 ml de 100 U mL-1 de
FITC-insulina sobre los parches de MN hinchables (0,5 x 0,5 cm). Durante el secado, las muestras se
protegieron de la luz.
Para corroborar la distribucin de FITC-insulina en las puntas hinchables de MN un parche fue cortado
y se caracteriz por microscopio de fluorescencia.
El parche de MN cargado con insulina FITC se aplic manualmente a tejido de piel de rata sin
cabello y se mantuvo durante 10 min o 4 h.
La penetracin del frmaco se evalu despus de la eliminacin del parche MN.
Como control se dejo una solucin de 0.1 ml de FITC-insulina sobre un rea de 0,5 x 0,5 cm de tejido
de piel de rata sin cabello y se mantuvo durante 10 min o 4 h.
Se analiz la intensidad de fluorescencia de la insulina FITC penetrada en la piel sin tratamiento
qumico. Se obtuvieron imgenes tridimensionales (3D) tomando imgenes mltiples de plano x-y con
un incremento escalonado de 3 m en la direccin z desde la superficie de piel de rata hasta una
profundidad de aproximadamente 600 m.
Resultado
Parches de MN cargados con insulina FITC se aplicaron a piel de rata extirpada. Antes de las pruebas
de penetracin, se investig la distribucin de encapsulado FITC-insulina en el MN hinchable despus
del proceso de carga. Como se muestra en la Fig. 5, la fluorescencia verde de la insulina FITC slo se
detect en la capa PS-PAA y la intensidad de fluorescencia fue similar con la profundidad de la
capa PS-PAA, lo que sugiere que la insulina FITC se distribuy uniformemente en la capa hinchable.
Despus de retirar los parches de MN hinchables entrelazados de la piel, se tomo una imagen
empleando un microscopio de dos fotones en cada sitio en el que se aplic el parche.
Las imgenes se registraron a profundidades crecientes desde la superficie de la piel para visualizar
la distribucin espacial de la insulina penetrada.
La administracin tpica (1 mL) de solucin de insulina FITC (10 U mL-1) sobre piel de rata se us
como un control y se formaron imgenes de la misma manera. No hubo cambios significativos en la
expresin de la fluorescencia de FITC (color verde) en la capa epidrmica y drmica con el tiempo
despus de la aplicacin tpica de FITC-insulina, lo que indica que la penetracin de insulina a
travs de la piel intacta fue completamente bloqueada (Figura 6a).
La regin drmica se visualiz por seal azul que surgen de segunda generacin de armnicos en el
colgeno. No se observ ninguna seal FITC aparente en las marcas punzadas o en el tejido
profundo de la piel en los primeros 10 min despus de la aplicacin del parche MN hinchable
cargado con insulina cargada con FITC, pero la intensidad de fluorescencia de la insulina FITC
aument 4 h despus de la aplicacin (figura 6b ).
El anlisis cuantitativo de fluorescencia basado en imgenes de dos fotones 4 h despus de la
aplicacin de los parches MN de FITC-insulina cargada resalt la permeacin eficiente de la insulina
a la regin de la dermis contrastando con la penetracin limitada de la insulina administrada
tpicamente .
Los MN bloqueados hinchados fueron retirados de la piel sin roturas, lo que indica que el nico
material que permaneca en la piel era la protena cargada
Conclusiones
Se demostr la viabilidad de la administracin prolongada de protenas transdrmicas utilizando un
parche MN en forma de bala con puntas hinchables, que ofreca las funciones duales de cargar los
frmacos protenicos con una prdida mnima de actividad proteica y firme adhesin al tejido
cutneo. El MN en forma de bala mostr una adherencia fiable y mejorada a la piel animal debido
a la formacin de una estructura favorable para el enclavamiento con tejidos.
Aprovechando la propiedad reversible de hinchamiento/deshinchamiento de los MN, la insulina se
carg en las puntas hinchables usando un procedimiento de gota/secado basado en la difusin
pasiva de soluciones de insulina. Se encontr que este mtodo de carga podra ofrecer una
encapsulacin eficaz de la insulina en la capa hinchable (> 90% de la cantidad total de insulina
cargada), dando como resultado una liberacin prolongada de la insulina cargada sin una
liberacin de rfaga.
Adems, aproximadamente el 70% de la insulina liberada a travs de una red de polmero hinchada
conserv su integridad estructural.
El parche MN hinchable cargado de insulina demostr acciones ms prolongadas de la insulina,
resultando en una disminucin gradual de los niveles de glucosa en la sangre en ensayos con
animales y un apego a largo plazo sin respuesta inflamatoria. Estos resultados sugirieron que los MN
hinchables podran adaptarse para proporcionar una conveniente plataforma de administracin sin
dolor para la administracin de insulina