1.

Apakah guna elektrophoresis dalam biologi

molekuler dan komponen-komponen apa
yang diperlukan .
2. Bagaimanakah cara mengetahui
pergerakan fragmen DNA dalam gel
agarose elektrophoresis?
3. Apakah fungsi medium SDS dalam
elektrophoresis?
4.Apakah guna DNA probe dan apa syaratnya
untuk molekul probe?
ELEKTROPHORESIS
 Alat untuk mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan
dalam suatu medan listrik.
Prinsip kerja elektrophoresis adalah berdasar
kan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion) yaitu DNA dari kutub negatif
(katode) menuju ke kutub positif (anode).
Hasil dari elektrophoresis akan terlihat
berbentuk band(garis-garis pita) pada gel
agarose atau nitro cellulose , yang
menunjukkan jumlah basa pada potongan
tersebut.
 1.
Untuk mengetahui ukuran partikel
DNA/RNA atau molekul protein .

2.
Untuk mengetahui bentuk partikel
DNA/RNA atau protein.

3.Untuk mengetahui ukuran basa N yang

dikandung
Sekuensing DNA tertentu.
 1. Alat-alat yang diperlukan.
> Bak (chamber) , diisi dengan buffer (SDS)
> Elektrophoresis plate, untuk menempatkan gel
agarose.
> Kutub-kutub katode atau anade.
> Power supply
> Sisir, untuk membuat sumuran sampel.

2. Bahan yang diperlukan .

> Gel agarose
> Sodium Dodecyl Sulphat (SDS)
> Zat warna : ethidium bromide atau bromophenol blue
 Adalah bahan untuk medium bergeraknya
fragmen-fragmen DNA dalam elektrophoresis
dari katode ke anode.
Pergerakan fragmen DNA pada gel agarose
dipenga ruhi oleh :
> ukuran partikel/fragmen DNA
> komposisi gel
> konsentrasi gel.
> densitas muatan
> daya medan listrik.
> medium (SDS)
 > 0,15 gr gel agarose + 15 ml 1 x TBE-
DEPC.
> Panaskan sampai agarose larut.
> Dinginkan sampai hangat kuku.
> Tambahkan ethidium bromide 10
ugr/ul.
> Tuangkan kedalam elektrophoresis
plate yang telah dipasang sisir( untuk
pembu atan sumuran pada agarose) dan
setelah gel padat lalu sisir diangkat.
> Tempatkan Elektroph plate pada
chamber.
 Bahan ini berguna untuk :
1. Melisiskan membran sel.
2. Denaturasi protein.
3. Menghambat aktivitas nuklese.
4. Pada medium elektroph. Melapisi
polinukleotida de
ngan muatan negatif, sehingga semua
polinukleo tida bergerak dari katode (-
) ke anode (+)
Dengan demikian semua molekul dalam
elektroph bergerak berdasarkan muatan ,
bukan karena berat molekul.
 Pengertian :
> Manipulasi asam inti dalam bab ini dimaksudkan
untuk mengaplikasikan asam inti dalam
berbagai kepentingan menggunakan teknik-
teknik hibridi sasi.
> Teknik-teknik hibridisasi dapat diaplikasikan
dalam bidang kesehatan, forensik,bioteknologi,
mendeteksi struktur asam inti dari suatu gene yang
mengalami kelainan atau terinfeksi oleh gene
asing.
> Adapun teknik-teknik tersebut adalah :
Hibridisasi DNA, PCR, LCR, RT-PCR, DNA sequencing dsb.
Komponen yang diperlukan dalam hibridisasi
DNA adalah :

I. DNA target
II. DNA probe
III. Sistem pendeteksian.
IV. Format hibridisasi
 Merupakan molekul DNA yang akan diteliti (
ingin diketahui struktur molekulnya).
Biasanya merupakan DNA yang terinfeksi oleh
DNA dari virus atau DNA dari bakteri.

Syarat DNA target:

1. merupakan DNA single strand
2. harus lebih dari satu copy dari tiap sel.
3. mengandung segmen dari semua kode
dalam DNA atau seluruh bagian dari
plasmid.
II. Molekul DNA/RNA probe
Molekul DNA/RNA probe dapat dibuat atau
disintesis secara kimiawi di labora torium,
sehingga strukturnya telah diketa hui sesuai
dengan kebutuhan.

Syarat-s yarat DNA/ RNA probe.

1.merupakan oligonukleotida, yang
tersusun dari 20 50 nukleotida.
2.Ujung 3 dari probe harus basa G/C
3.Ujung 3 tidak boleh lebih dari 2 basa N yang
sama, mis GG/CC.
4.molekul probe harus mengandung reporter
untuk membentu mendeteksi adanya ikat
an antara probe dengan DNA target
 Untuk mendeteksi keberhasilan proses hibridisasi dapat dilacak dengan
menggunakan reporter yang dilekatkan pada DNA probe.
Reporter harus dapat berfloresensi bila kena sinar ultraviolet.
Macam reporter:
a. Zat radioaktif, misalnya : P32 (phosphat radioaktif).
Penggunaan zat radioaktif dihentikan karena
membahayakan lingkungan.
b. Zat nonradioaktif, biasanya berupa enzim yang dapat
berfloresensi bila kena sinar UV, misalnya: > > Florescen
isothiocyanate
>Chemiluminescent moities.(mis: acridinium ester).
>Biotin, mempunyai avinitet tinggi terhadap avidin dan
streptavidin. Biotin merupakan derivat vit.B yang larut dalam
air. Probe yang dilabel dengan biotin menghasilkan resolusi
hibridisasi tinggi, danstabil pada suhu 20 derajad C selama
setahun.
Zat-zat tersebut tidak beracun dan ramah terhadap lingkungan, tetapi
sensitifitasnya rendah
 1 Menghilangkan gugus phosphat pada
ujung 5 dengan enzim alkaline phosphat.

2. Kemudian bagian tersebut diganti dengan

gugus zat radioaktif atau reporter yang lain
dengan enzim polinukleotida nuklease.
 1. Enzim terminal transferase:
Untuk mengikatkan reporter pada ujung 3 dari DNA
probe.

2. Enzim Polinukleotida kinase:

Untuk mengikatkan reporter pada ujung 5 dari DNA
probe.

3. DNA polimerase I:
Untuk menghilangkan sebagian ujung dari DNA probe
untuk ditempeli reporter
 ds DNA
(dari virus atau sel target dalam buffer)
+pelarut alkali denaturasi DNA
ssDNA
+nitrosellulose/nylon untuk melektnya ssDNA
ssDNA
(melekat pada nitrosellulose)
+probe bereporter dlm bufer *unt.berhibridisasi ssDNA
ssDNA
(berhibridisasi dengan probe)
+ buffer Unt.pencucian sisa
probe
ssDNA hibrid**
 1. Konsentrasi molekul probe ug/ml (X)
2. Kompleksitas probe (Y)
3. Volume reaksi dalam ml (Z)

Waktu hibridisasi:

Co t1/2 = 2(1/x)(y/5)(z/10)
 Faktor-faktor yang mempengaruhi
daya ikat antara DNA target dengan
DNA probe (DNA hibrid)
1.Banyaknya pasangan DNA yang salah.
2.Suhu dalam proses hibridisasi (pada suhu
tinggi dengan kadar garam medium
rendah, ikatan menjadi lemah).
3.Konsentrasi garam dalam medium hibridisasi
(kadar garam tinggi pada medium menye
babkan hibridisasi stabil).
4.Kondisi pH dalam medium reaksi hibridisasi.
(pada pH 6 7, menyebabkan ikatan stabil.