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Mthodes de dosage

immunologique
ou
immunochimie
c
La raction Ag-Ac
rsulte de la fixation dun dterminant antignique sur un site
paratope de lanticorps. Cette raction est immdiate, spcifique
et rversible .Dans le cas dun Ag
macromolculaire(multivalent), il peut stablir de nouvelles
interactions entre les rgions de lAg et de Ac .
Diffrente classes des mthodes immunologique:

A-Immunodosage sans marqueurs :


Observation directe des effets de la raction Ag-AC
A-1-Immunoprcipitation:
Un immunoprcipit correspond la formation dun rseau
rsultant de lunion spcifique entre de nombreux antignes et de
nombreux anticorps. Lantigne soluble et molculaire mis en jeu
est gnralement une protine ou un polyoside.
Les ractions dimmuno- prcipitation se droulent en trois
tapes :
*Liaison de lAc au dterminant antigniques
*Formation dun rseau par rarrangement des sites de liaison
*Agrgation des rseaux et formation de prcipit visible loeil
nu.
1-Prcipitation en milieu liquide:
Test de l'anneau ( ring test )
C'est un test qualitatif. On introduit dans un tube des
antignes et des anticorps et on laisse reposer. Ils vont
lentement diffuser dans le milieu, crant des gradients de
concentration. Lorsqu'ils sont l'quivalence, c'est--dire
qu'il y a autant de paratope que d'pitopes, ils forment des
complexes et prcipitent.
Immunoturbidimetrie:
la quantit de complexes Ag-Ac en solution est value en
mesurant la diminution de lintensit de la lumire incidente.

Avantage: ralis sur un simple spectrophotomtre


Inconvenant: concentration relativement lev de ractif
Application: CRP, Albumine, transferrine, haptoglobine, les
apoprotine, LDL-chol.
Sensibilit: 5mg/l
Immunonphlomtrie :
la dviation de la lumire dans un prcipit dpend
de sa concentration. On peut alors doser les antignes
ou les anticorps par un nphlomtrie.
Avantage: La consommation de ractif est inferieur
celle de la turbidimtrie
Application: Ig, complment, facteur rhumatode et
les haptnes ( mdicaments).
Sensibilit: 0.5g/l
2-Precipitation en milieu gelifi:

Technique o Ac et Ag diffusent dans le milieu glifi.


La prcipitation est obtenue dans la rgion du gel o
Ag/Ac se trouvent dans des proportions permettant la
formation du rseau.
Appliques l'analyse qualitative d'un mlange d'Ag
dans une solution
Et au dosage immunochimique d'un Ag.
Technique historique d'immunodiffusion en tube de Oudin
Elle n'est pratiquement plus utilise. Elle consiste couler
dans un tube une solution d'agar contenant un antisrum et de
dposer sur l'agar aprs glification une solution d'Ag qui
diffusera dans le gel formant un gradient de concentration. La
prcipitation a lieu l'endroit o les concentrations en Ag et Ac
correspondent la zone d'quivalence.
Immunodiffusion radial:Mancini
L'anticorps est inclus dans le gel encore chaud et coul sur
une bote de Ptri ou plaque en verre.
Dans des puits creuss dans l'agarose, on met l'antigne
doser.
Ag diffuse et forme avec lAc des anneaux de
prcipitation dans le diamtre est proportionnel a la
concentration de lAg a dos .
elle permet de prciser la concentration d'une solution
inconnue de lAg par la simple mesure du diamtre du cercle
de prcipitation. Cette mthode est ventuellement applicable
aux Ac.
Immunodiffusion (ou double diffusion) en plaque
d'Ouchterlony
L'agar est coul soit en bote de Ptri, soit sur lames de verre
et ne contient initialement ni Ag ni Ac.
Dans un deuxime temps, des puits creuss dans le gel
servent de rservoirs les uns pour des solutions d'Ag et les autres
pour des srums immuns.
Dans la zone de rencontre de l'antigne avec l'anticorps(zone
d'quivalence), il se forme un arc de prcipit au bout de 24 48
heures.
lectro-immunodiffusion de Laurell ou lectrophorse en
fuse (rocket)
Proche de la technique de Mancini, la diffusion de l'antigne est
acclre par un champ lectrique. La migration se fait dans une
seule direction, et le prcipit ressemble une fuse (rocket) ou
une flamme .La hauteur du prcipit est proportionnelle la
concentration de l'antigne. Des facteurs de la coagulation sont
doss par cette mthode. Le rsultat est accessible en quelques
heures.
A-2:Agglutination:
1 Principe:
Les ractions dagglutination mettent en jeu un Ag situe a la
surface dune particule de taille comprise entre le dixime et la
dizaine de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes,
spermatozodes, micro-organismes, billes de latex ou de
spharose). Cest un phnomne complexe au cours duquel les
Ac sunissent aux Ag ports par la particule formant ainsi des
ponts spcifiques entre ces particules permettant leur runion en
amas.
1-Agglutination directe:
Elle rsulte dune union spcifique entre un Ac
agglutinant et un Ag appartenant en propre a la
particule. Elle peut se faire en tubes, en microplaques
ou sur lame et peut tre qualitatives ou quantitatives.
Application:
Serogroupages bacteriens (Salmonella, Shigella, E. coli,
enterophathogenes):
Groupage sanguin ABO :
Agglutination indirecte:
dans se cas l antigne est adsorb ou fix grce un procd
chimique (glutaraldhyde) sur une particule (globules rouges ou,
plus rcemment, sur des particules inertes (latex, polystyrne).
Application:
diagnostic des anmies hmolytiques auto-immunes (coombs
indirect)
Dtection des facteurs rhumatodes : raction de latex et
Waaler-Rose.
Dtection des autoanticorps antithyrodiens :
thyroperoxydase, thyroglobuline.
Diagnostic de la syphilis
Dtection d'anticorps dans :
les infections virales : cytomgalovirus, rubole, mononuclose
les infections bactriennes : streptocoque, mycoplasme;
les infections fongiques : Candida ;
les infections parasitaires : toxoplasmose.
B-Immunodosage avec marqueur:
La liaison de l'Ac l'Ag est objective par diffrentes
mthodes utilisant le marquage direct des Ac ou des Ag de la
raction Ag-Ac ou celui indirect des Ac marqus dirigs contre
des Ac de la raction Ag-Ac . Les Ag marqus permettent de
localiser les Ac l o ils se trouvent et les Ac marqus servent
identifier in situ les Ag et effectuer des dosages d'Ag ou d'Ac.

Ces techniques comportent une tape de reconnaissance


immunologique, suivie de la mesure du signal mis par le
marqueur, ce dernier pouvant tre fix aussi bien l'antigne qu'
l'anticorps
Diffrents types de marqueurs:
marqueurs radio-isotopes
marqueurs enzymatiques
marqueurs fluorophores
marqueurs luminescent
1-Marquage par un isotope radioactif (RA*)
Marquage in vitro
* Par remplacement d'un des atomes "naturels" de
la molcule par un isotope RA* tel que le tritium H ou
le phosphore
*Par introduction d'un atome nouveau RA* comme
dans le marquage par l'iode 131 ou 125
2-Marquage par une enzyme
l'enzyme est utilise comme marqueur par association
l'aide de liaisons covalentes ou non avec l'Ag ou l'Ac . L'agent
chimique de couplage entre l'enzyme d'une part et l'Ag ou l'Ac
d'autre part, ne doit pas modifier de faon notable l'activit de
l'une ou de l'autre.
2-a:Mthodes de couplage :
*couplage par le glutaraldhyde
Le glutaraldhyde est un aldhyde dont les fonctions CHO se
lient aux groupements amins des lysines de l'enzyme, l'Ac ou
l'Ag
2-b:Enzymes utilises comme marqueurs et leur
substrat:
Phosphatase alcaline d'Escherichia coli
Le substrat habituel est le paranitrophnyl phosphate
(PNPP ) qui donne le paranitrophnol (PNP) color en
jaune rvl par colorimtrie a 405 nm.
Galactosidase :
le substrat est le galactoside qui donne le 2-nitrophnol
color en jaune et rvl par colorimtrie
3-Marquage par un fluorochrome :
Les fluorochromes les plus utiliss et la couleur de leur
fluorescence sont :
-Isothiocyanate de fluorescine = fluorescence verte
-phycorythrine = fluorescence rouge.
-isothiocyanate de rhodamine, acide sulfonique de
rhodamine et rouge Texas = fluorescence rouge-
orang,
-acide sulfonique du 1 dimthyl aminonaphtalne =
fluorescence rouge.
Les marqueurs chimiluminescents
Les marqueurs chimiluminescents mettent de la lumire
aprs absorption d'nergie chimique. Les principaux
marqueurs ou systmes utiliss sont :

- les phtalhydrazides (luminol, isoluminol et drivs),


- les esters d'acridinium,
- le systme lucifrine-lucifrase.
Ils sont dtects par luminomtrie
Mthodologie:
des immunodosages peuvent tre classs en deux
grandes catgories. En fonction des concentrations
relatives en anticorps et en antigne, on distingue :
*les techniques dites par comptition ;
*les techniques dites en sandwich (ou par
extraction-saturation).
1-Comptition:
Tchnique:
*Lanticorps est immobilis.
*Une quantit limite danticorps est utilise; cette
quantit est insuffisante pour lier toutes les
molcules dantigne dans lchantillon.
*Lchantillon, contenant une quantit inconnue de
lantigne, est mlang avec une quantit fixe et
connue de lantigne marqu.

* Lantigne dans lchantillon et lantigne marqu


sont en comptition pour un nombre limit de
sites anticorps.
*La concentration de lantigne dans lchantillon
peut tre dtermine partir de la proportion de
lantigne marqu qui est li lanticorps ou de la
proportion qui demeure libre en solution.
*Pour des rsultats quantitatifs, il est essentiel de
garder le rapport danticorps (ractif limitant)
antigne marqu constant.
les techniques par excs dAc dites en sandwich :
Principe: L'analyte prsent dans le spcimen doser se lie
aux sites anticorps de capture en excs fixs sur le support
solide( tube, billes de verre, de polymres, particules
magntiques ou diverses) .
L'anticorps de rvlation marqu et en excs ajout au
milieu ractionnel, se lie alors l'antigne dj fix sur le
premier anticorps. L'analyte se trouve ainsi littralement pris
en sandwich entre les deux anticorps. Il suffit enfin
d'liminer l'excs d'anticorps marqu et mesur le signale qui
augmente avec la concentration de lAg.
Traceur Dosage avec Dosage sans
comptition comptition
(anticorps limitant) (anticorps en excs)

Radiomarqu Radioimmunoassay Immunoradiometric


(RIA) assay (IRMA)
Enzyme Enzymoimmunoassa Enzyme-labeled
y (EIA) immunosorbent
assay (ELISA)
Fluorescent Fluoroimmunoassay Immunofluorometric
(FIA) assay (IFMA)
Chimi ChimiLuminoimmun ImmunoChimilumino
Luminescent o metric assay
assay (CLIA) (ICLMA)