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Amlioration des plante

par des mthodes de


biotechnologie
CHAPITRE II.
Mthodes dhaplo diplodisation
CHAPITRE II
Mthodes dhaplodiplodisation
exprimentale et son utilisation en
biotechnologie
I Androgense
II Gynogense
III Culture dembryons aprs
croisements interspcifiques et
intergnriques
IV Applications
Amlioration des plantes par des mthodes de
biotechnologie dhaplo-diplodisation:
Mthodes dhaplo-diplodisation:
Dfinition:
-Cest le processus aboutissant la formation de plantes haplodes ou haplodes doubls.
-Une plante haplode est une plante qui possde un nombre de chromosomes identique
celui des gamtes de la plante dont elle est issue.
-La plante haplode possde une morphologie identique mais elle est plus rduite et strile.
-Le doublement artificiel (colchicine bloque la mitose) du nombre de chromosomes permet
de restaurer la fertilit. La plante obtenue est dite haplode double ou dihaplode.
Intrts:
-La production dhaplodes permet:
Aux gnes rcessifs de sexprimer en absence dhtrozygotie: les caractres ne sont
pas perdus grce lhomozygotie des dihaplodes, on peut donc connaitre tous les
caractres du gnome (important pour les slectionneurs et gnticiens).
*cration varitale: haplode double.
*grain de temps par rapport la slection traditionnelle.
Recherche de mutants spontans ou provoqus (rayon ou produit chimique): les
relations de dominance entre allles ninterviennent pas et les caractres rcessifs
sexpriment et donc les mutants sont directement observables.
Production de plantes haplodes:
1-Spontanment dans la nature rare, exemple- parthnogense (dveloppement du
gamte femelle-oosphre-sans fcondation: oosphre N embryon puis plante N
chromosome.
-Apomixie= formation dembryon sans fcondation partir de cellules autres que
loosphre tel que cellule synergide ou antipode).
2-Induites exprimentalement:
Androgense:
-culture danthre.
-culture de microspores
Exprimentalement isoles.
lhaplo-diplodisation
se fait par 3 types de Gynogense ou culture
mthodes des ovules ou des
ovaires.

Croissements
interspcifiques et
intergnriques.
En rsum:
-Lhaplodie in vitro consiste cultiver sur milieu synthtique des anthres, des microspores, des
ovules ou des ovaires ou des embryons haplodes issus des croissements intergnriques ou
interspcifiques.
A/Androgense:
1-dfinition: Andro= homme, gense= volution. Cest la formation dune plante partir dun
microspore ou dun grain de pollen le plus souvent qui se trouve dans un anthre.
2-Dcouverte de landrogense et primer travaux.
*1964 Guha et al. Obtiennent des embryons sortant des loges polliniques chez Datura aprs 15
jours culture danthre: origine ??
*1966/67 origine= embryons N chromosome issus de microspores chez Datura.
3-Technique de culture danthres cest la mthode la plus facile techniquement.
-Mthode permet: la coupure des liens entre lanthre et plante mre.
-Certaines corrlations sont maintenues: tissus danthres et microspores positive ou ngative.
-Prsence de cellules N et 2N (cellule de paroi).
4-Voies de landrogense aprs culture danthre. Il y a 2 voies:
*directe androgense.
*indirecte en passant par un cal.
5-Diffrenciation androgntique des microspores.
5-1. rappel : diffrenciation normale des graines de pollen.
5.2- Diffrenciation et dveloppement
Androgntique des microspores

Comportements possibles du
pollen mis en culture in vitro
Chez le tabac: Nicotiana selon
Sunderland 1971-1974
Voies Androgntique chez le tabac

Voie a
division
gale

Spore
uninucle
Voie b
Division
ingale
La division gale du microspore est anormale, cause??
Hypothse:
-choc de mise en culture? Donc drangement de la division cellulaire?
-coupure des corrlations avec la plante mre??
6-Techniques de culture:
-Culture danthre intact sur milieu solide (agent glifiant) donc simple.
-Technique simple facile de ralise.
7-Rendement en embryons haplode:
Rd initial=(nombre de microspores embryogne)/(nombre total microspores)
-En gnral plusieurs milliers/40 000 (par anthre tabac)
-Exemple: Rd= 200/40000 x 100 ; Tabac Rd=20 40% ; Riz Rd=1/30000
8-facteurs dindiction de landrogense:
8-1- facteur gnotype:
-Cest le facteurs dterminant dans la plupart des cas.
-Certaines familles, genre, espces et varits sont plus <<dous>> que dautres pour
landrogense.
Familles prdisposes:
*Dicotyldones= Solanaces-Nicotiana tabaccum-Datura innoxia
*Monocotyldones= Gramines: riz- orge mas..
-A lintrieur du genre il y a des diffrences entre espces:
*Triticum aestivum +++++
*Triticum durum +
-A lintrieur des espces il y a des diffrences entre varits:
*Etude 1: chez tomate sur 100 varits 10/100.
une rponse Andro.
*Etude 2: chez tomate sur 43 varits 3/43.
une rponse Andro.
Origine de cette diffrence de rponse??
-Ziv et al. 1984 ont montr chez la tomate que le:
*gne ms 10^35 (gne nuclaire) de strilit mle favorise landrogense. Ce empche la
diffrenciation du pollen: microsporogense arrte au stade miose.
*utilisation dun << gamtocide (empche la diffrenciation des microspores en pollen)>>
appliqu au champ au bl et qui provoque la strilit mle favorise landrogense.
8-2. facteurs physiologiques:
a)-Environnement de la plante donneuse:
-Les facteurs (temprature, densit lumineuse, hygromtrie) agissent sur lembryogense des
anthres.
Bl: -meilleurs en plein champ.
-aussi augmentation de la temprature 7 jours avant est favorable.
b)-Stade de microsporogense du pollen:
-Stade de microsporogense au moment de la mise en culture du pollen conditionne leur
volution ultrieur.
-Stade dpend du gnotype, chez la plupart des espces les microspores dont le dveloppement
est arriv au dbut ou la moiti du stade uninucle offrent de meilleurs rsultats en
androgense in vitro.
Tomate= stade miose-ttrade.
Tabac= stade microspore uninucle.
-On utilise le bouton floral ferm, lorsque la longueur des ptales est gale la longueur des
spales.
Ptunia et Brassica= stade microspore binucle.

2/3

pis prlevs lorsque leur ptie


apicale atteint le tiers sup de la
gaine
c)-Prtraitement appliqu aux explant:
1-temprature basses:
-Nitsh et Moreel, chez Datura ont montr quune temprature fraiche de 3 augmente
landrogense.
traitements % danthres embryognes
Tmoin= ensemencement direct des 1.59%
anthres.
2jours 24 des boutons floraux puis 3.5%
isolement et culture danthre.
2jours 3 puis isolement et culture 23%
danthre.
-Temprature ??
-Moment (stade des microspores) du prtraitement ??
-Chez le tabac, le choc 5C, 7C et 9C.
-7C et 9C taient les meilleurs et juste avant la mitose pollinique.
-Si le choc thermique est appliqu bien avant la mitose pollinique ou un stade plus tardif
(binucle) pas deffet.
Rle du froid ??
-On fait une tude de cytologique du pollen au chaud et froid
Au froid= plus de mitose pollinique de type gale.
Sans traitement= plus de mitose de type ingale.
-Donc plus on a de division de type gale plus on a de lembryogense.
Hypothses sur laction du froid:
1-Sur le plan cytologique le froid stimule la division gale des microspores plus dembryons.
2-Action conservatrice du froid (survie).
3-Le froid ralentit la diffrenciation du pollen.
2-tempratures leves:
-Chez Brassica temprature=35C stimulatrice de landrogense.
-Chez le piment 35C pendant 2 4 jours (en culture) stimule.
d)-Le dimorphisme pollinique:
-Chez certaines espces comme tabac, orge, anmone.
-Deux types de pollen:
*pollen +gd+colorable+nombreux+diffrencis.
*pollen+petit-colorable-nombreux-diffrencis, pas damidon.(cest le plus efficace car moins
diffrencis) cest le plus embryon qui donne les plantes haplodes.
-Le prtraitement au froid augmente la proportion des grains de pollen (petits embryon ??).
-Chez les espces sans les deux types de pollen in vivo le froid les cres in vitro.
8-3-Rle des facteurs physiques et chimiques:
1-facteurs physiques:
-Position des anthres: chez Datura la position plat avec un contact max avec le milieu de
culture donne le meilleur rsultat.
-Temprature dincubation au cours de la culture dpend de lespce, chez Datura:
Datura: *15C Rien
*20C Rien
*25C ++++++++
*30C ++
*Sup 30C Rien hors des conditions physiologique.
-La lumire dpend du gnotype chez Datura: lumire positif.
Obscurit= peu dembryon.
-La majorit des travaux montrent: obscurit ncessaire au cours de linduction et lumire pour
la rgnration (bl).
2-facteurs chimique:
A- Milieu minral:
-Les milieux les plus utiliss sont:
Le milieu (Murashige et Skoog,1962) MS.
Le milieu R9 (pas dhormones)pour la rgnration chez le bl.
B- Rgulateurs de croissance:
-Prsence est gnralement favorable:
-Les auxines:
2,4-D pas deffet chez Datura, Ptunia.
Gramines 2,4-D indispensables 10^-8M 10^-6M.
ANA 10^-7 10^-4 ont effet chez Ptunia.
AIB 10^-6 donne le plus grand nombre dembryon par anthre.
AIA 10^-5 donne le plus grand nombre danthre embryon.

-Cytokinines:
Kin, Za, BAP, rle trs important: action positif sur nombre danthre embryon et sur nombre
dembryon par anthre.

2/ Etapes de productionde
plantes haplodes par
culture danthres: cas du
bl
3- Landrogense chez le bl (MADAME
CHERKAOUI )
Ensemencement
des graines en Doublement Evaluation du
parcelles la nombre de
colchicine chromosomes

Prlvement des thalles


Plantule verte ou albinos
un stade prcis

Repiquage des
Choc thermique embryons sur milieu de
48h 4c rgnration

Isolement des anthres et


ensemencement en boites
Dsinfection des pis
de ptri
4- Problme dalbinisme:
Problme majeur:
-Chez les crales surtout chez le bl dur le taux dalbinisme aprs culture
danthre dpasse 99%. Ce taux est de 77% chez le bl tendre.
-Ce problme est du a une diffrenciation incomplte des proplustes en
chloroplastes.
-Vaugr et al., 1980= plastes des albinos endommages et donc incapables de se
dveloppement en chloroplastes.
- des divisions rapides des cellules qui inhibent la synthse en quantit suffisante
de protines de structure spcifique ncessaire la formation de chloroplastes.
-Zhou, 1996 a suggr que lalbinisme peut tre caus par lexpression des gnes
rcessifs sous les conditions dhaplodie.
Culture de microspores isoles(lobjet des recherches
les plus actives):
1-Dfinition:
La culture des microspores isols est une culture qui se fait en dehors de la paroi des anthres.

2-Avantages:
A- Les microspores (40000 Datura) sont disperss dans un milieu de culture au lieu dtre
comprims les microspores: culture homognes sur milieu de culture.
B- Culture monocellulaire: on est sr que toutes les cellules sont N et pas de mlange de cellule.
C- Pas de conditionnement de la paroi de lanthre on limine les corrlations positive ou
ngative.

3-Mthodes de culture:
3-1-Culture de microspores avec prculture des anthres:
-Technique mise en vidence par Nitsch et Moreel 1973 chez Datura.
-Cette technique consiste cultiver des anthres en milieu liquide en attendant, ou en
provoquant louverture des loges polliniques et la libration dans le milieu des microspores:
mthode non considrer comme culture de microspores isoles au sens strict.
Protocole exprimental: Mthode de Nitsch et
moreel chez Datura 1973
Prtraitement des CULTURE INITIALE DES
anthres 3 ANTHERES SUR
PENDANT 2J MILIEU LIQUIDE jusqu
ouverture des loges des
Rsultat? anthres PENDANT 1-5 J
corrlations avec l
anthre maintenues
un certain temps
stimulation ou Retrait des anthres
inhibition Prlvement des
microspores et culture sur
milieu frais
Rsultats obtenus chez Datura:

Culture du pollen sur milieu liquide simple (sans prsence de paroi).


Ne donne rien
Culture du pollen sur milieu liquide simple+extrait danthres Embryons.
Rle de lextrait danthres ??
Nitsch 1974 montre que:
-Anthres riche en srine et glutamine.
Milieu + srine et glutamine Embryons.
3-2- Culture de microspores isoles sans prculture des anthres:
-La culture des microspores isoles au sen strict implique un isolement pralable des
microspores qui seffectue le plus souvent par broyage mcanique des anthres ou
des inflorescences, suivi de filtrations et centrifugations
Protocole exprimental pour
isolement et culture de microspores
du bl tendre utilis par Picard et
Debuyser -1998- labo ORSAY PARIS-
SUD
Prtraitement de des
pis 3-4 PENDANT
des
2J-14J

Dsinfecter des pis

Dissection des pillets

Mettre les pillets dans un bol dextraction


plac sur un broyeur rgl une faible vitesse
Broyer durant 10s

La solution du broyage est filtre sur tamis puis


transfr sur tube centrifuger

Centrifuger 3 fois 5 min 100g


Puis liminer le surnageant
Au niveau du culot dterminer le nombre de
microspores sur cellules nageotte
Puis ajuster 50 000 microspores /ml

Mettre en culture en BP 1,5 ml de la


suspension de microspores

Co-culture dovaires
Prlever aseptiquement 5 10 ovaires
partir dautres pillets et les mettre en
culture dans la BP contenant les microspores
Aprs 15j les embryons sont visibles
Aprs 3 semaines les embry sont repiqus sur
milieu MS sans hormones
Aprs 4 semaines 1000embry/boite
Rle de la Co-culture:
-Leffet positif de lincubation des ovaires dans le milieu de culture a t observ chez lorge:
Les ovaires enrichissent le milieu en pr-aminoacides et hormonaux.
Conclusion:
Le rendement en embryons par cultures de pollen isols nest actuellement suprieur que pour
le colza et lorge.
Donc la culture danthre reste plus efficace.
B/ Gynogense:
1-dfinition:
-Elle consiste mettre in vitro des ovaires ou des ovules non polliniss pour la production de
plantes haplodes.
-Peu tudier par rapport landrogense.
2-origine du dveloppement in vitro du gamtophyte femelle:
-Ce dveloppement peut avoir diffrents origines a partir:
Des antipodes chez Crpis.
Des synergides chez Hva.
-Chez le bl tendre: embryons partir de loosphre, antipodes, des noyaux polaires.
3-facteurs influenant sur la gynogense:
-Ces facteurs sont en gnral similaires ceux influenant sur la culture danthre.
Stade de dveloppement du sac embryonnaires:
-La dtermination directe du stade du dveloppement du sac embryonnaires est dlicate donc
recours aux mthodes indirecte:
Chez lorge= plantes obtenus au stade mature du sac embryonnaire= stade binucl du pollen.
4-Protocole exprimental pour
isolement et culture dovaires du
bl tendre utilis par
MADAME Mdarhri Alaoui
Gynogense chez le bl (MADAME
MDARRHRI Alaoui-1998-)
Ensemencement des Doublement la colchicine
graines en parcelles Des plantes n chro

Prlvement des thalles: Plantule verte ou albinos

pis occupent le tiers


sup gaine foliaire ( fin Repiquage des
stade uninucle ) embryons sur milieu
de rgnration

Choc thermique 5c
5 10jours Isolement des ovaires non
fconds et
ensemencement en boites
Dsinfection des pis
de ptri
Conclusion:
-Gynogense: chez le bl tendre pas dalbinisme moins mthode peu
tudie et limite par le faible nombre dovaire en comparaison avec
le nombre danthre.

c) Haplodiplodisation par
croisements interspcifiques
et intergnriques
Croisements intergnrique:
-Lhybridation intergnrique est une mthode dHaplodiplodisation, en raison de llimination
slective et spontane du gnome du parent pollinisateur au cours des premires divisions
cellulaires de lembryon.
La varit de bl tendre croise avec le mas (Zea mays).

Taux de russite de 22% (22 embryons forms pour 100 fleurs pollinise).

Lembryon issu de ces croissements pourrait dgnrer si on le laisse sur la plante mre
plus de 10 14 jours aprs leur formation.

Le zygote issu de ce croisement contient une combinaison de 210 grands chromosomes


de bl et 10 petits chromosomes du mas.
Ces derniers sont rapide limins au cours des trois premires divisions cellulaires,
donnant un embryon haplode avec des chromosomes du parent.
Croisements
interspcifiques
Semis de grains d'orge Croisements
interspcifiques

Vernalisation
Isolement des
embryons, dsinfection
limination des anthres) et ensemencement in
vitro

2 3 jours

Rcolte du pollen
d'Hordeum bulbosum (2n = les pis sont recouverts
14) et pollinisation aprs par des sachets
24h transparents
APPLICATIONS PAR
HAPODIPLOIDISATION
Exemple dhaplodisation: cas des asperges
a)- donnes botaniques:
Dioque= mle et femelle 50% -50% .
b)- problmatiques de lamlioration et de la culture:
-Les pieds mles sont plus productifs et plus prcoces:
le sexe est dtermin par un gne majeur 2 allles
M et m.
-Les plantes mles sont htrozygotes Mm .
-Les plantes femelles sont homozygotes rcessives
mm.
Objectif de
lamelioration
-Obtention dhaplode par culture danthre des plantes mles
htrozygotes Mm sont utilises pour tablir des cultures danthres :
Des structures embryon des haplodes sont obtenues, puis aprs
ddoublement chromosomique spontane les plantes rgnres
conduisent des clones diplodes:
Soit homozygotes MM appels super mles.
Soit homozygotes mm donc femelles.
-Le croisement entre clones homozygotes super mles et les clones
homozygotes femelles produit des hybrides htrozygotes et
entirement mles Mm.

MM M M
mm
m Mm Mm
m Mm Mm
les clones
homozygotes
femelles/ avec
50% mle + super mles
50% femelle
Varits Plantes
actuelles
100%
mle