ANALISA SENYAWA ORGANIK

indro-juni-2009 KFA 1
Tahapan analisa sampel :
1. Memisahkan senyawa aktif dari campuran matriknya
(maserasi, ekstraksi, destilasi)
2. Pemurnian (cleaning)
3. Identifikasi Senyawa aktif:
a. Reaksi Warna (spot test) dan reaksi pengendapan
b. Pembentukan kristal spesifik (dilihat di mikroskop)
c. Spektroskopi
d. Kromatografi (HPLC, GC, GC-MS)
4. Penetapan Kadar :
a. Uji kesesuaian sistem
b. Pengukuran/penentuan absorpsi pada lambda maksimal
c. Pembuatan kurva baku
d. Pembuatan dan pengukuran sampel simulasi
e. Pengukuran perolehan kembali (% Recovery)
f. Pengukuran sampel
indro-juni-2009 KFA 2
BAHAN BAKU FARMASI

SEDIAAN OBAT TANAMAN OBAT

PROSES PEMISAHAN
JAMU

OBAT PALSU
indro-juni-2009 KFA NARKOBA 3
NARKOBA
PROSES PEMISAHAN SAMPEL YANG DIPERIKSA
Bahan baku obat yang jelas identitasnya, tidak dilakukan
proses pemisahan mengikuti metode Farmakope.
Sediaan obat yang jelas identitasnya, diekstraksi
menggunakan pelarut yang sesuai untuk melarutkan senyawa
yang diperiksa, tanpa melarutkan matriks yang mengganggu.
Sediaan obat palsu yang tidak jelas identitasnya,
diekstraksi secara bertingkat, mengikuti metode Stass Otto.
Sampel yang berasal dari tanaman obat yang jelas
identitasnya, dilakukan preparasi bertingkat, mengikuti
prosedur baku analisa fito kimia.
Sediaan jamu yang tidak jelas identitasnya, dilakukan
ekstraksi secara bertingkat, mengikuti metode Stass Otto.
Sampel Narkoba yang tidak jelas identitasnya, dilakukan
ekstraksi secara bertingkat, mengikuti metode Stass Otto.
indro-juni-2009 KFA 4
Bahan baku/Sediaan Obat Jelas Identitasnya :
Bahan tersebut ada Pemilik/Penanggung jawabnya
Wadah dalam keadaan tertutup (tidak rusak)
Ada etiket/label yang menunjukkan nama senyawa tersebut
Ada nomor batch/kode produksi
Nama produsen tertera dalam etiket
Ada Certificate Analysis (CA) dari produsen

Bahan baku/Sediaan Obat Tidak Jelas Identitasnya :

Bahan baku/sediaan obat yang diduga palsu/dipalsukan
Bahan baku/sediaan obat ilegal

indro-juni-2009 KFA 5
 PROSES PEMISAHAN CARA STAS OTTO
Jika senyawa atau sediaan farmasi dalam bentuk campuran
atau dalam campuran matriks, harus dilakukan langkah-
langkah pemisahan dan pemurnian terlebih dahulu
sebelum dilakukan proses identifikasi.
Proses pemisahan yang paling umum dilakukan adalah proses
ekstraksi. Kelarutan setiap senyawa terhadap pelarut
tertentu tergantung dari sifat-sifat kimia masing-masing zat
dan afinitasnya terhadap pelarut tersebut pada kondisi
tertentu.
Untuk memisahkan senyawa obat, sudah sejak lama
dikembangkan berbagai macam metoda, diantaranya cara
Stas-Otto yang disederhanakan. Dengan metode tersebut
dapat dipisahkan lebih dari 100 macam campuran senyawa
obat.

indro-juni-2009 KFA 6
Cara analisisnya berdasarkan prinsip :
(1) Pembagian senyawa ke dalam fase air dan fase pelarut
organik yang tidak tercampur dengan air.
Pada sebagian besar obat (khususnya yang berbentuk
padat), pemisahan dengan cara membedakan ke dalam
fase air dan fase pelarut organik saja masih kurang
memuaskan, sehingga dilakukan prinsip yang kedua, yaitu
:
(2) Pembentukan ataupun penguraian garam.
Prinsip ini menyangkut perbedaan kelarutan, yaitu bahwa
garam lebih bersifat hidrofil, sedangkan bentuk asam atau
basanya lebih bersifat lipofil.
Kebasaan ataupun kesaman larutan serta bermacam-
macam (keragaman) sufat pelarut (lipofil atau kuirang
lipofil) memungkinkan pemishan lebih lanjut.

indro-juni-2009 KFA 7
PROSES PEMISAHAN CARA STAS OTTO
Contoh senyawa pada setiap fraksi
Fraksi IA Asam karbonat, fenol, zat netral
Fase Eter (suasana asam) Glutemid, propilfenazon, tolbutamid, pentobarbital,
warfarin, asam salisilat, parasetamol, dietilbestrol,
barbital, fenobarbital, nitrazepam.

Fraksi IB Senyawa netral

Fase eter (suasana basa) Benzokain, glutetimid, meprobamat, hidrokortison,
diazepam, bisakodil

Fraksi II Asam, fenol dan zat netal yang larut kloroform

Ekstrak kloroform dalam Amitriptilin, imipramin, defenhidramin, siklobarbital,
suasana asam tartrat nitrazepam, kafein, reserpin, klordiazepoksida

indro-juni-2009 KFA 8
PROSES PEMISAHAN CARA STAS OTTO
Contoh senyawa pada setiap fraksi
Fraksi III Berbagai senyawa basa
Ekstrak Eter (suasana basa) Efedrin, kodein, kinidin, etilmorfin, atropin, strihnin

Fraksi IV Berbagai basa fenol

Ekstrak kloroform-iso Pilokarpin, sulfanilamid, parasetamol, tetrasiklin
propanol dalam suasana
basa amoniak

Fraksi V Asam hidrofil, sulfonamida, karbohidrat, asam

Senyawaa yang tidak amino, ammonium kuarterner
terekstraksi dengan pelarut Ampisilin, asam glutamat, asam askorbat,
organik isoniazid, hidroklortiazid, sulfaguanidin

indro-juni-2009 KFA 9
 PREPARASI
1. SAMPEL DIHOMOGENKAN 2. DITIMBANG SEKSAMA

indro-juni-2009 KFA 10
3. DILAKUKAN PROSES EKSTRAKSI/PEMISAHAN

indro-juni-2009 KFA 11
 4. PEMISAHAN FASA

PEMISAHAN FASA PENYARINGAN DENGAN

DENGAN CARA KLASIK FILTER ABSOLUT

Filter absolut

indro-juni-2009 KFA 12
 5. PROSES PEMURNIAN (CLEANING)

DIEKSTRAKSI KEMBALI PEMISAHAN FASA

DENGAN PELARUT
BERBEDA

indro-juni-2009 KFA 13
 5. MEMBUAT VARIASI KONSENTRASI /
PENGENCERAN
PEMIPETAN DAN VARIASI KONSENTRASI
PENGENCERAN

indro-juni-2009 KFA 14
 6. PENYARINGAN ULANG

DISK FILTER PROSES PENYARINGAN

indro-juni-2009 KFA 15
 6. PROSES IDENTIFIKASI

A. REAKSI WARNA B. PEMBENTUKAN KRISTAL

SPESIFIK

indro-juni-2009 KFA 16
 6. PROSES IDENTIFIKASI
C. SPEKTROFOTOMETRI D. KROMATOGRAFI

indro-juni-2009 KFA 17
 6. PROSES PENGUKURAN KADAR

A. SPEKTROFOTOMETRI B. KROMATOGRAFI

indro-juni-2009 KFA 18
 FILTER
Pada Dasarnya filtrasi adalah suatu proses
separasi/pemisahan secara fisikalis/mekanis terhadap zat
dalam fasa yang berbeda. Dibutuhkan energi seperti
tekanan atau vakum (tekanan yang berbeda).

Bentuk-bentuk pemisahan antara lain:

Zat padat/zat air:
Contohnya: Pemindahan partikel dari air.
Zat padat/zat yang bersifat/dalam bentuk gas:
Contohnya: Pengumpulan udara dari mikro organisme.
Zat cair/zat yg bersifat/dalam bentuk gas:
Contohnya. separation of water drops out of compressurized
air
indro-juni-2009 KFA 19
 Filter non absolut(FNA)
Bahan Filter
Polypropylene
Glass Fiber
Kapas
Karbon aktif, Pasir
Applikasi
Pemisahan partikel besar
Klarifikasi
Penjernihan

indro-juni-2009 KFA 20
 FNA

Retensi partikel
melalui:
Saringan
adsorsi
Penjebakkan
high
secara fisik
pressure

Fibers
indro-juni-2009 KFA Particles 21
 Terminologi Filter Absolut
hydrophilic Filter absolut:
"water-loving" Filter yang mudah dibasahi
dengan air.
hydrophobic Filter absolut:
"water-repellent" - Filter yang kedap air

indro-juni-2009 KFA 22
 Hydrophilik/Hydrophobik
Hydrophilik:
Dapat dibasahi dengan air.
aqueous Jenis filter ini dapat digunakan untuk media air.

Hydrophobik:
Kedap air, dan tidak dapat dibasahi dengan air,
aqueous kecuali larutan seperti alkohol (contoh PTFE dengan
tegangan permukaan 28 dyn/cm).
Air Jenis filter ini bukan untuk air melainkan untuk gas.
Hal ini penting untuk menghindari penetrasi atau
pertumbuhan mikroba melalui filter.

indro-juni-2009 KFA 23
 Pori - Pori Membrane
Ukuran pori yang sering dipakai
Ukuran pori Pemakaian yang Tipikal

0,2 m Filtrasi steril

0,45 m Pemeriksaan bakteri mikrobiologi
di QC
0,65 m Pemeriksaan jamur

0,8 m Clarifikasi atau penjernihan ultra

1,2 m Filtrasi penjernihan
3,0 m } Pemisahan partikel dsb

indro-juni-2009 KFA 24
 Disk Filter

1 - 600 cm2 Luas Permukan

filter Effective (LPE)
Volume yang tertahan rendah
Dapat di otoklaf
Siap dipakai sebagai
disposabel (syringe filter) atau
terpasang di filter holder

Discs
indro-juni-2009 KFA 25
 SPEKTROFOTOMETER
SINGLE BEAM DOUBLE BEAM

indro-juni-2009 KFA 26
indro-juni-2009 KFA 27
 SINGLE BEAM
KUVET
AMPLIFIER

SUMBER MONOKROMATOR KOMPARTEMEN DISPLAY

CAHAYA SAMPEL DETEKTOR

Hanya single light beam dari monokromator yang melalui kompartemen

sampel
* Pada jenis spektrofotometer ini, sampel dan reference (larutan blanko)
harus diletakkan pada kompartemen sampel secara bergantian.

indro-juni-2009 KFA 28
 DOUBLE BEAM

KUVET
REFERENCE

MONOKROMATOR
AMPLIFIER

SUMBER
CAHAYA DETEKTOR

DISPLAY

KUVET KOMPARTEMEN
SAMPEL SAMPEL

indro-juni-2009 KFA 29
Spektrum Kafein

indro-juni-2009 KFA 30
 KURVA KALIBRASI
Abs = m*Concentration + K0
Absorbance

Slope m = e l

Analyte concentration (ppm)

indro-juni-2009 KFA 31
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

indro-juni-2009 KFA 32
 BAGIAN DARI SISTEM HPLC

detektor

kolom
injektor
pompa oven

Wadah
solven

indro-juni-2009 KFA 33
 SISTEM ELUSI ISOKRATIK

pompa injektor oven

detektor

kolom

Solven tunggal
indro-juni-2009 KFA 34
 SISTEM GRADIEN
LOW-PRESSURE

low pressure
gradient valve detektor

kolom
injektor
pompa oven
Satu pompa mengontrol
4 reservoir; pencampuran
terjadi sebelum pompa.
data
processor
indro-juni-2009 KFA 35
 SISTEM GRADIEN
HIGH-PRESSURE

pompa
mixer
kolom detektor

pompa oven
injektor

data
processor
pompa
indro-juni-2009 KFA 36
BAGAIMANA PEMISAHAN TERJADI
DALAM KROMATOGRAFI

Dalam kromatografi terdapat dua fase :

Fase Diam :
padat, berpori, material aktif permukaan
dalam bentuk partikel kecil atau pendukung
padat yang dilapisi lapisan tipis cairan.
Fase gerak :
gas atau cairan.
indro-juni-2009 KFA 37
BAGAIMANA PEMISAHAN TERJADI
DALAM KOLOM KROMATOGRAFI
m = fase gerak
s = fase diam

Ref. V.R. Meyer

Practical High-
Performance Liquid
Chromatography

Representation of a chromatographic separation

indro-juni-2009 KFA 38
 Kolom HPLC fase normal
Silica gel : pemakaian umum
Cyano : pemakaian umum
Amino : analisa gula
Diol : analisa protein
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si
Modifikasi Si
Silica gel Si
indro-juni-2009 KFA 39
 HPLC fase Terbalik
Kolom : Non polar property
C18 (ODS)
C8 (octyl)
C4 (butyl) -Si-C18H35
Phenyl
TMS
Si
Cyano

Solven : Polar property

air / metanol / asetonitril
indro-juni-2009 KFA 40
 Bagaimana interaksi?

Interaksi
hidrofobik Solven polar

Non-polar
indro-juni-2009 KFA 41
 Fase Normal vs Terbalik

Parameter Normal Phase Reverse Phase

Polarity of Column High Low
Polarity of Solvent Low High
Elution Sequence Low Polarity First High Polarity First
Increase Solvent Polarity Faster Elution Slower Elution

indro-juni-2009 KFA 42
 HPLC Analytical Columns
1. Packed with various
particles.
2. Are often
unidirectional.
3. Are often preceded
by a preparative or
guard column.
4. Usually have 3-5
mm diameter but of
micro-columns or
capillary columns
ranges from 3 m to
200 m.
indro-juni-2009 KFA 43
 DETEKTOR HPLC

Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)

Detektor Photodiode Array (PDA)
Detektor Fluorescence (RF)
Detektor Konduktivitas (CDD)
Detektor Refraktive Indeks (RID)
Detektor Elektrokimia (ECD)
Detektor spektrometer massa

indro-juni-2009 KFA 44
 Chromatogram Animation

Column

indro-juni-2009 KFA 45
 Typical Chromatograph

indro-juni-2009 KFA 46
 KROMATOGRAM DAN GUNANYA
1. Kualitatif
waktu retensi selalu konstan dalam setiap
kondisi kromatografi yang sama.
dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
luas puncak proporsional dengan jumlah
sampel yang diinjesikan dan dapat digunakan
untuk menghitung konsentrasi

indro-juni-2009 KFA 47
 KROMATOGRAM DAN GUNANYA
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi
efisiensi pemisahan dan kinerja kolom :

faktor kapasitas (k)

Selektifitas (a)
Jumlah pelat teoritis (N)
jarak setara dengan pelat teoritis (HETP)
Resolusi (Rs)

indro-juni-2009 KFA 48
 TAMPILAN LAYAR HPLC

indro-juni-2009 KFA 49
 SISTEM PENGOLAHAN DATA

Sinyal yang didapat dari detektor akan direkam

dalam bentuk kromatogram dan diolah
INTEGRATOR : CR-6A
CR-7A
PC-BASED SOFTWARE
End.

indro-juni-2009 KFA 50