Competencia y Transformacin

JA Card, PhD
Biol 4019 -Lab Biologa Celular
Molecular
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
 Objetivos
Definir los conceptos de clulas competentes
y transformacin.
Comparar y contrastar las ventajas y
desventajas de los diferentes mtodos
utilizados para preparar clulas competentes.
Preparar clulas competentes usando el
mtodo de cloruro de calcio.
 Introduccin
En muchas ocasiones el DNA purificado es
introducido en clulas eucariotas y microorganismos,
con la intensin de alterar el genotipo del recipiente.
Existen varios mecanismos por los cuales las
bacterias pueden recombinar informacin
genticamente.
Transformacin, la habilidad que posee una bacteria
de obtener una molcula de DNA exgeno e
insertarla en su propio genoma En algunas bacterias
la transformacin es un proceso natural en otras es
un proceso creado por la manipulacin humana.
 Introduccin
La tcnica de transformacin es utilizada en los
en Biologa Celular y Molecular para introducir
artificialmente una molcula de DNA dentro de
una clula bacteriana.
Este procedimiento permite amplificar clones
de DNA que sern utilizados para estudios y
anlisis posteriores .
La bacteria puede ser transformada con un
vector de expresin que contiene la secuencia
de DNA que codifica para la protena
 Clulas Competentes
La membrana plasmtica se compone de una
doble capa de fosfolpidos, que crea un
interior hidrofbico que no permite el paso de
molculas exgenos a travs de ella.
Varios mtodos son utilizados para aumentar
la permeabilidad de la membrana plasmtica
y que el DNA exgeno pueda atravesar la
barrera.
mtodo qumico y electroporacin.
clulas competentes.
 Mtodo Qumico
La bacteria es tratada con altas concentraciones
de Cloruro de Calcio (CaCL2) y temperaturas fras
para aumentar la permeabilidad de la
membrana.
Los iones de cloruro de calcio neutralizan la
repulsin entre la carga negativa de las cabezas
de los fosfolpidos y la carga negativa de los
grupos fosfatos del DNA.
Las clulas competentes producidas por este
mtodo pueden ser almacenadas a -70 C..
 Electroporacin
El mtodo de electroporacin fue desarrollado
originalmente para transformar clulas eucariotas.
Desde el 1988 se esta utilizando para transformar E. coli
y otras bacterias.
Este mtodo capitaliza la naturaleza dbil de las
interacciones hidrofbicas e hidroflicas de la bicapa de
fosfolpidos y la capacidad espontnea de la membrana
de auto-sellarse despus de un disturbio.
La clula recibe una corriente elctrica que altera
temporalmente la estabilidad de ciertas reas de la
membrana plasmtica, permitiendo que molculas
polares puedan atravesar la membrana.
 Electroporacin
La electroporacin produce una transformacin ms
eficiente que los mtodos qumicos.
La eficiencia de este procedimiento depende de la fuerza
del campo elctrico, el largo del pulso elctrico y la
concentracin del DNA.
 Materials
Centrfuga clnica
Cloruro de Calcio 0.1 M
Cultivo de E. Coli
Hielo
Microtubos de 1.5 ml
Pipetas desechables de 5 ml
Pipetas desechables de 1 ml
 Protocolo: Mtodo Qumico
Obtenga un tubo con cultivo de E. coli y colquelo por 10
minutos a 0 C (hielo).
Centrifugue el tubo con el cultivo de E. coli por 10
minutos a 4,000 rpm.
Decante el sobrenadante. Debe observar las clulas
formando un precipitado en el extremo inferior del tubo.
Invierta el tubo sobre un papel toalla. Djelo reposar por
un minuto. Esto permite eliminar cualquier residuo del
medio que quede en el tubo.
Resuspenda el precipitado en 5 ml de 0.1 M CaCl2 (fro).
Colquelo en hielo por 10 minutos.
 Protocolo: Mtodo Qumico
Centrifugue el tubo por 10 minutos a 4,000 rpm.
Decante el sobrenadante. Invierta el tubo sobre un papel
toalla y djelo reposar por un minuto.
Resuspenda el precipitado de clulas competentes en
500 l de 0.1M CaCl2 (fro).
Transfiera los 500 l de clulas competentes a un
microtubo de 1.5 ml.
Rotule correctamente su microtubo y gurdelo a 70 C.
 Preguntas
Compare y contraste las semejanzas y diferencias entre los dos
mtodos principales por los cuales las bacterias son inducidas al
estado de competencia.
Explique porqu algunas cepas de la bacteria E. coli pueden ser
inducidas al estado competente y otras cepas no.
Tendr el CaCl2 el mismo efecto en una bacteria gram positiva que
en una bacteria gram negativa? Explique su respuesta.
Qu efecto tienen las temperaturas fras en la preparacin de
clula competente a travs del mtodo qumico?
Usted prepar clulas competentes por el mtodo de cloruro de
calcio. Cmo usted comprobara que estas clulas se encuentran
en su estado de competencia? Explique su respuesta.