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Introduccin
Sistema inmune innato:
Componentes celulares:
Macrfagos.
Clulas dendrticas.
Componentes Humorales:
electroforesis.
Combinadas con
electroforesis.
La Ig G es mala aglutinante.
Reacciones de inhibicin
Es la ms sensible de todas las tcnicas de aglutinacin. Se utilizan
hemates. Ya se conoce el antgeno problema, y lo hemos
pegado a la superficie de los hemates. Lo que intentamos ver es
cuando se produce la inhibicin del proceso de aglutinacin. A
mayor cantidad de antgeno, menor capacidad de aglutinacin
voy a tener. Partimos de cantidades conocidas de antgeno y
anticuerpo, y prosigo aadiendo antgeno.
Se utiliza para ver en asesinatos o violaciones el RH o grupo
sanguneo del acusado. Esto se hace si haymuestras de semen o
saliva. Tambin puede concluirse si existen restos de drogas en
las muestras.
Existe un problema en la utilizacin de estas tcnicas, dado que los
hemates se destruyen en un perodo de tiempo muy corto. Para
solucionar este problema se intenta utilizar bolas de ltex. De
todas maneras casi todos los reconocimientos han de realizarse
con sangre fresca.
Tcnicas que utilizan el
complemento.
Estas tcnicas se crearon para poder medir el complemento de
un individuo. Para poder llevarlo a cabomedimos
componente por componente y nos fijamos si el
complemento activo forma poros en las membranas de los
hemates.
Para ello se utilizan hemates de oveja, anticuerpos de conejo
o antihemates de la propia oveja, adems del suero
problema con C1-C9. Ponemos a incubar el conjunto. Los
anticuerpos se pegarn a los hemates, activando el
complemento, que provocara poros en estos, causando la
lisis, que podemos observar.
Deben compararse con controles, y debemos fijarnos en que
cantidad hace falta para lisar el 50% de los hemates. La
cantidad de suero que hace falta para lisar el 50% de los
hemates se denomina CM50 y se utiliza como unidad de
medicin de la actividad del complemento.
Fijacin del complemento.
Existe competencia entre el control y la muestra problema
para la unin del anticuerpo y el antgeno. Hay que aadir
complemento conocido, e inactivar el complemento a 56 a
hora. Tenemos anticuerpo conocido, complemento conocido,
hemates de oveja con anticuerpo pegado, y nuestro
problema con o sin antgeno .
Si no hay antgeno los hemates rodeados de anticuerpo que
reconocen el antgeno, activndose el complemento
provocando las lisis Hemolisis -> Control positivo.
Si existe antgeno, los hemates rodeados de anticuerpo que
reconocen el antgeno, pero como no hay complemento libre
no se produce la lisis de los hemates No hay hemolisis.
Se utiliza para detectar enfermedades provocadas por virus,
richetsia y hongos. El complemento tambin se utiliza para
purificar, matando especficamente aquellas clulas para las
que aadamos anticuerpo.
Tcnicas de ligando.
Marcamos el antgeno o el anticuerpo, sin modificar
sus propiedades de reconocimiento antgeno-
anticuerpo.
Podemos realizar el marcaje con:
Radioactividad RIA.
Enzimaticamente EIA, ELISA.
Emisin de luz.
Fluorescencia.
Radio Inmuno Anlisis (RIA)
Protocolos de
inmunizacin.
Lo mejor es inmunizar varias veces. Entre una
respuesta primaria y la segunda se tarda
menos. La primera vez se tardan semanas,
la segunda necesitamos menos tiempo y
obtenemos mas anticuerpo. Suelen
repetirse las inmunizaciones. Se realiza la
primera, tras 20-30 das las segunda,
dejamos dos o tres semanas y hacemos la
tercera, para finamente extraer el bazo. Los
tiempos varan entre los distintos
protocolos.
Obtencin de anticuerpos
policlonales.
Purificar antgeno: Hay una protena (Protena A) que tiene mucha afinidad por las
inmunoglobulinas
(Especialmente por la G), concretamente por la porcin Fc. Puede comprarse la
protena A asociada a
bolitas de ciertos polmeros. Diseamos una columna con la protena A mas el
anticuerpo y le pasamos la mezcla de antgeno, solo quedndonos los antgenos
en la columna, ya que el resto sale en el diluido. Hacemos lavados para quitar
todo aquello no especfico que nos quede. Separamos ahora el antgeno el
anticuerpo, ya sea bajando el pH o modificando la molaridad del buffer.
Normalmente el buffer es glicina a pH 3, para no estropear el antgeno.
Purificar anticuerpos especficos: La columna lleca bolitas de sephadex rodeadas
de antgeno, y hacemos pasar muestra con antgeno especfico mas otras cosas,
pero solo se un el anticuerpo
Western-Blot
Combina electroforesis con transferencia en membrana y posterior
incubacin con anticuerpo. Nos permite saber el peso molecular
de una determina protena. Lisamos las clulas, y realizamos una
electroforesis en gel de acrilamida, poniendo el lisado. Utilizamos
marcadores de peso molecular. Se hace doble, uno de ellos lo
teimos y otro lo transferimos a una membrana de nitrocelulosa o
nylon, mediante carga elctrica.
En esta membrana quedan pegadas las protenas. Ya
tenemos las protenas. Incubamos con anticuerpo contra lo
que queremos saber, y estos lo reconocen. Se lava y se
aade un anticuerpo secundario marcado
(Enzimticamente normalmente) que detecta el anticuerpo
primario. Aadimos el cromgeno, viendo la unin en color.
Comparando con el patrn de pesos moleculares, sabemos
el peso molecular del antgeno.
A veces esta tcnica no sale, pudiendo ser debido a que en el
proceso de ponerlos con SDS para cargar las protenas, el
anticuerpo se desnaturaliza.
Inmunoprecipitacin
Es un aparato que pretende analizar una a una todas las clulas que pasan por
una capilar muy fino donde incide in rayo lser, y donde habr filtros y
espejos que nos dirn el tamao que tiene esa clula, su complejidad y si
va rodeada con fluorocromos de un color, otro o ambos. Los resultados
salen en una grfica tal y como nosotros le indiquemos. Por ejemplo, en
una grfica de tamao frente a complejidad obtendramos
esta grfica en una persona sana.
Podemos saber tantos por cientos de las distintas clulas
(Con distintos fluorocromos). Podemos pedir grficas
y tantos por cientos de todos los parmetros que mide el
citmetro de flujo.
El citmetro posee muchas mas funciones, y es de uso
obligatorio en centros hospitalarios, para la realizacin
de gran nmero de pruebas. Entre ellas cabe destacar:
ejemplo, con marcador verde en un tubo y rojas en otro. Cargamos gotas en el citmetro, y lo
sometemos a un campo elctrico, desplazando el tubo que nosotros queremos.
Microscopio de florescencia: Solo hay una distancia de trabajo, donde veremos la preparacin.
Microscopio confocal: Podemos en tejidos gruesos, enfocar en todo momento. Podemos adems
guardar todas
las imgenes secuencialmente y ponerlas forma tridimensional.
Microscopio electrnico: Mayor definicin, que tambin puede utilizar tcnicas inmunolgicas.
Inmunologa celular.
Tema 7:
Podemos ir a mdula o timo, pero lo normal es la utilizacin de la sangre, ya que la linfa es ms
difcil.
Tambin podemos ir a los ganglios linfticos. Tambin podemos obtener el bazo. Los rganos tienen
mezcla
de clulas. Se han desarrollado tcnicas de separacin celular.
Separacin por gradiente de densidad.
Usamos una sustancia que por centrifugacin nos las separe por gradiente de densidad.
Ahora, utilizamos una pipera pasteur para recoger la banda donde se encuentran los linfocitos
y lo pasamos a
un medio especfico. Centrifugamos para quitar el ficol (Sustancia densa). Hemos obtenido
linfocitos y
monocitos parcialmente purificados.
Adherencia a nylon (Linfocitos B, Macrfagos y clulas muertas).
El nylon tiene una serie de propiedades que hace que las clulas B, los macrfagos y las clulas
muertas se
adhieran a el. Podemos aprovechar esta capacidad para separar clulas de una mezcla.
Si queremos recuperar posteriormente los linfocitos B, junto con los macrfagos, debemos de
exprimir el
nylon, para que estas clulas se suelten del nylon.
Si lo queremos obtener son los macrfagos, existe un mtodo mas sencillo, utilizando un medio
plstico
donde se adhieren los macrfagos. Utilizamos una protena como la albmina para forrar el
plstico. Si
aadimos la mezcla, solo los macrfagos se pegarn. Al lavar nos quedaremos con ellos pegados, y
se irn las
dems clulas no adherentes. Para separarlos utilizamos o bien un agente qumico (Un querante de
calcio,
EDTA, tripsina...) o bien simplemente rascando el fondo de la placa plstica.
Rosetas con hemates de carnero.
Algunas clulas forman rosetas con los hemates de carnero. Lo hacen aquellas que presentan CD2
en su
membrana. Es el caso de los linfocitos T. Los linfocitos B y los macrfagos no presentan esta
molcula, y por
lo tanto no forman rosetas con estos hemates.
especfico. Lavamos. Bajamos el pH para separar y ya tenemos el anticuerpo especfico para una
sustancia.
Purificar anticuerpos no especficos: nicamente purificamos anticuerpo con la capacidad de
pegarse
a la protena A mas el sephadex. En la columna habr protena A mas sephadex y pasaremos las
muestras.
Existen otras protenas adems de la A, como la protena G o la L, que se unen a una cadena ligera
kappa.
Tambin pueden utilizarse otros tipos de cromatografa. Existen otras tcnicas para el anlisis y
purificacin
de los anticuerpos, como pueden ser el Western-Blot o la inmunoprecipitacin.
Avidez: Es el sumatorio de fuerzas que se establecen entre un antgeno y un anticuerpo. Una Ig
M unindose
por varios brazos tendr alta avidez aunque su afinidad sea pequea. Depende de la afinidad y de
las
valencias, as como de la estructura en el espacio.
Especificidad: Sera ideal cuando el anticuerpo solo reconoce un determinante antignico. No
siempre es
ideal.
Anticuerpo heterfilo: Se han generado frente a un determinado organismo y son capaces de
reconocer otras
cosas en otras especies distintas.
Crossreaccin: Posee reaccin cruzada. El anticuerpo detecta otras estructuras que no debera,
pero puede
llegar a ser til en las tcnicas.