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Anlises Forenses

Prof.Ms.Emerson L.B.Loureno.
Toxicologia Forense
Definio: Cincia que detecta e identifica a
presena de drogas e venenos em fludos
corpreos, tecidos e rgos.
Toxicologia Forense
Funes diversas;

Toxicologia Forense x Toxicologia Analtica;

Vrias matrizes para anlises;

Mtodos qumicos sofisticados (derivao


qumica, cromatografia, espectrometria de
massa);
Compostos Volteis
Compostos da forma liquida que podem ser
detectadas por tcnicas de cromatografia
liquida ou gasosa, quando as matrizes podem
sofrerem mtodos de extrao apropriados.

Extraes Liqudo-Liqudo, head space, Micro


extrao em fase slida e extrao em fase
slida.
Substncias Corrosivas
Incluem cidos minerais e bases;

Vrios agentes corrosivos so constituintes


normais dos tecidos;

Modificaes das concentraes qumicas no


plasma podem determinar as leses;
Metais
Clssicos procedimentos de separao de
matrizes orgnicas so utilizados para
determinao de metais ( Ex: agentes qumicos e
oxidao trmica);

Tcnicas analticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e


ICP-MS);

Diferentes formas de metais ( Mercrio,


dimetilmercrio);
Componentes orgnicos no volteis
Drogas prescritas e ilcitas, praguicidas,
produtos naturais, poluentes e compostos
industriais;

Dificuldade de Separao....
A
N

L
I
S
E
S
Papel da Toxicologia analtica
BIOTRANSFORMAO DO BENZENO NO FGADO E MEDULA SSEA

FGADO
CytP450 CytP450
Benzeno fenol hidroquinona
[O] [O]

MEDULA SSEA
Prostaglandina sintetase
Hidroquinona radical fenoxil
(aplasia de medula )
Como determinar?
O que procurar nestas amostras?
CH3 OH CH3
CH2 CH N
CH2 CH N
CH3 H
CH3 H

metanfetamina efedrina
anfetamina
H
CH2 CH N
CH3 H

CH2CH2CN OH H
CH2 CH N CH CH N
CH3 H CH3 H

femproporex fenilpropanolamina
ESTERIDES ANABLICOS
OH OH
ANDROGNICOS
OH

HO
H O
O
1-Androstenodiol Boldenona Cl Clostebol
OH H5C2 OH
CH3 OH
C CH

H N
N
H O
O
Estanozolol Gestrinona Nandrolona
OH OH H5C2 OH
CH2CH3

THG
O O O
OH Oxabolona Trembolona
AGENTES ANABLICOS
1. Esterides anablicos andrognicos

Algumas dos esterides mais utilizados:


- metandienona (Dianabol),
- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)
- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)
- oxandrolona (Anavar)
- enantato de metenolona (Primobolan)
- estanozolol ( Winstrol)
- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinrio
Agentes anablicos
1. Esterides anablicos andrognicos

Efeitos txicos

-Coletases e tumores no fgado, mais


freqentemente com o uso de
derivados C-17 alquilados. Carcinomas
hepticos associados aos E.A. no
produzem metstase e regridem aps
a descontinuao do uso.
O ciclo letal de Andreas Munzer
0-10 semanas antes da competio:
-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol,
hormnio da tireide.
6-10 semanas antes da competio:
-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)
-1 inj. Parabolan (Trembolona)
- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-30 comp. Metandienona
-20 doses GH
-20 doses insulina
3-5 semanas antes da competio:
-3 inj. Masteron (Drostanolona)
-2 inj. Parabolan(Trembolona)
-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-50 comp. Stromba (Estanozolol)
-2 inj. Stromba
-24 doses GH
-20 doses insulina
OUTROS: EPO, diurticos
ESTERIDES ANABLICOS
ANDROGNICOS

Baixas concentraes

DETECO
URINA
O desafio dos anabolizantes
Contedo da seringa

18-homo-pregna-4,9,11-trieno-17-ol-3-ona

4,9,11- trieno-3-one
Designer steroids

Esterides de desenho
Tetraidrogestrinona Concluses de Catlin et al.

i) Novo esteride, nova entidade qumica.

ii) Sem registro de CAS.

iii) Nunca antes usado em humanos ou animais.

iv) Nunca testado em screening farmacolgico.

v) Propsito nico burlar o exame de dopagem.

vi) O esteride de desenho.


O desafio dos anabolizantes
Caracterizao do THG
CLUB DRUGS: Freqentadores de festas raves.

MDMA: Ecstasy, plula do amor.


GHB: Ecstasy lquido.
Cetamina: Special K, Kit kat.
Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB.
LSD (cido, doce, ponto).
Fenciclidina: PCP.
Nitritos (Poppers).
Utilizadas em assaltos e estupros.
Efeitos: Incapacidade de reao e
amnsia retrgrada.

R
Flunitrazepam (FNZ)
o FNZ ilcito GHB
h
y
p
n
o
l
WWW.DEA.GOV
GHB
Gama-hidroxibutirato (Ecstasy lquido, GBL).
GHB
Definio:

Gama-hidroxibutirato (Ecstasy lquido, GBL.


Natural em SNC de mamferos.
Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.
Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e
estupros).
Lquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.
Popularizado na dcada de 1980 - realar o efeito do etanol .
Uso crescente por todo o pas.
Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento
para narcolepsia.
Alguns congneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol
(solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).
GHB
Mecanismo de ao:

Receptores s no SNC, principalmente hipocampo.

Liga-se fracamente em receptor GABA b.

Depressor do SNC.

Provoca liberao de opiides endgenos.


GHB
Farmacocintica:
Incio de ao: 15-30 min e pico plasmtico
em 25-45 min.
Metabolizado em CO2 .

GBL convertido GHB por via no enzimtica.


1-4 butanediol convertido GHB pela lcool
desidrogenase.
Efeito Bifsico. A ingesto concomitante de etanol, leva a
uma inibio competitiva pela lcool desidrogenase,
retardando a metabolizao do 1-4 butanediol. Assim,
pode haver uma depresso inicial do nvel de conscincia
seguido por uma melhora quando o etanol metabolizado
e logo em seguida evoluo para coma com a
disponibilizao da lcool desidrogenase.
DOB - (Cpsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-
bromoamfetamina

www.baladacerta.com.br surforeggae.ig.com.br
DOB - (Cpsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-
bromoamfetamina
Derivado anfetamnico acrescido de um tomo de bromo (
responsvel por potencializar o efeito da droga e por aumentar o
tempo de ao).
Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967.
Cpsula transparente com capacidade de 500 mg que contm cerca
de 1 a 1,5 mg da substncia.
CH3
N ster metil ecgonina
O
C O CH (15-35%)
3

OH
CH3
N
N
H Norcocana N
CH3
O
C O CH
3 O (2-6%) O
C O CH C
O 3 OH
O C
O
O C OH

Cocana
Ecgonina
(3%) N
CH3
(1-8%)
O
C OH

O Benzoilecgonina
O C
(15-50%)
Amostras
PRAGUICIDAS

a) Derivados do cido fosfrico.


b) Derivados do cido tiofosfrico.
c) Derivados do cido ditiofosfrico.
d) Derivados do cido fosfnico.
Derivados do cido fosfrico.

Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfs, Monocrotofs.


Derivados do cido Tiofosfrico.

Ex: Cloropirifs,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metlico


Derivados do cido Ditiofosfrico.

Ex:Azinfs,etion,forato,malation,tiometon
Derivados do cido Fosfnico.

Ex:Triclorfon
Oral, respiratria e drmica.

Biotransformao
Oxidao

Ligao ao sitio enzimtico

x
cido Carbmico

Aldicarb,Carbaril,Carbofuran
INSETICIDAS ORGANOCLORADOS

So compostos de estruturas cclicas, bastante


lipoflicos e altamente resistentes aos
mecanismos de decomposio do
ambiente.Os principais organoclorados com
atividade inseticida so:

a) Hexaclodienos e anlogos.
b) DDT e anlogos.
c) Ciclodienos.
d) Dodecacloro e clordecone.
DDT

2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO


DDT
CICLODIENOS

Aldrin Dieldrin
PIRETRIDES
TCNICAS DE PREPARAO DE
AMOSTRAS EM ANLISES
TOXICOLGICAS

-A preparao de amostras pode ser considerada como uma srie de


operaes unitrias necessrias para que determinada substncia
(analito) possa ser detectada pela tcnica analtica de escolha.
Tpicas operaes em preparao de
amostras:

1) Liberao dos analitos da amostra


2) Remoo de interferentes endgenos
3) Tcnicas de extrao
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
1) Liberao dos analitos da matriz

-Como se encontra o analito na matriz?


-conjugado/livre
-matriz?
BIOTRANSFORMAO
Maconha - 9THC
cido 11-nor-
CH3 O delta-9-THC-
C OH COOH
OH
OH

CH3
O C5H11 CH3
CH3 O C5H11
CH3
Delta-9-
Tetraidrocanabinol O
(THC) C O cido glicurnico

OH

cido 11-nor- delta -9


CH3 -THC-COOH
O C5H11 conjugado
CH3
SUBSTNCIAS CONJUGADAS

-Hidrlise
-Alcalina
-cida
-Enzimtica
HIDRLISE ALCALINA
-Exemplo
O
O
C O cido glicurnico
C OH
OH
60C OH

NaOH
CH3
CH3
O C5H11
CH3 O C5H11
CH3

cido 11-nor- delta -9


cido 11-nor-
-THC-COOH
delta-9-THC-
conjugado
COOH
HIDRLISE CIDA/ALCALINA
-Vantagens:
-processo mais rpido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradao de analitos no estveis
p.ex. benzodiazepnicos
HIDRLISE CIDA/ALCALINA
Benzodiazepnicos
CH3
CH3 O
N H
N
HCl
O
Cl N 100C Cl
15 min.

Diazepam Benzofenona
HIDRLISE ENZIMTICA

Beta glucuronidase
Esterides 55C Esterides
Anablicos Anablicos
conjugados 1 hora
livres
HIDRLISE ENZIMTICA
-Vantagens:
-no degrada os analitos
- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reao
-controle mais rigoroso das condies
-enzimas podem ser inibidas por substncias
presentes nas amostras
-aconselhvel o uso de controle
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo

-Matriz complexa
-como retirar os analitos do cabelo?
-digesto da matriz (soluo de NaOH 1M e temperatura 70C
durante 20 minutos)
substncias estveis (THC, anfetaminas)
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo

-E para substncias no estveis?


P.ex. cocana

CH3
-Incubao em soluo
N
cida ou metanol durante
O 18 horas a 50C
C O CH
3

O
O C
2) Remoo de interferentes
endgenos

Uma matriz biolgica consiste de


muitos componentes, como protenas,
lipdios, carboidratos que podem interferir
na anlise.
2) Remoo de interferentes
endgenos

A) Precipitao de protenas:
A remoo de protenas por desnaturao ou precipitao muitas
vezes necessria principalmente em amostras como sangue total ou
plasma. A principal razo de remover protenas que elas podem
precipitar em contato com a fase mvel, obstruindo a coluna de
HPLC.
Mtodos de precipitao:
a) com cidos ( p.ex. cido tricloroactico e cido
perclrico)
-formam sais insolveis com a forma catinica
das protenas em meio cido

b) com solventes orgnicos


-solventes que so miscveis em gua como acetona,
metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a
solubilidade de protenas.
Mtodos de precipitao:
c) com sais metlicos: protenas tambm podem ser
removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou
cobre em condies alcalinas.
-no : analitos que complexam com metais.

b) sulfato de amnio: O sulfato de amnio um


precipitante relativamente ineficiente: < 75% das
protenas so removidas com a adio de 1,5mL de sol.
Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser
possvel injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.
Precipitao de pigmentos e sais biliares
Pigmentos urinrios e sais biliares podem produzir altos
backgroundsque podem interferir na quantificao de analitos. A
remoo desses compostos com extensos esquemas de extrao
podem ser relativamente difceis ou demorados. Sua remoo pode
ser feita preferencialmente por precipitao com sais de chumbo.
3) Tcnicas de extrao

-Extrao lquido-lquido (LLE)


-Extrao em fase slida (SPE)
-Extrao por head space (HS)
-Micro extrao em fase slida (SPME)
EXTRAO
(lquido-lquido)

Solvente
orgnico
urina
Drogas/
urina
metablitos

Agitao

Centrifugao Separao da fase


orgnica extrato
EXTRAO
(lquido-lquido)
INFLUNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
substncias de carter cido. Ex. cido 11-nor-delta -9-THC-
COOH
O
C OH

OH Forma
O
C OH H+ no-
ionizada
CH3
O C5H11
OH CH3

O
CH3 C O
O C5H11
CH3 OH
Forma
cido 11-nor-delta -
OH- CH3
ionizada
9-THC-COOH O C5H11
CH3
EXTRAO
(lquido-lquido)
INFLUNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
substncias de carter bsico. Ex. anfetaminas

H H
+
CH2 CH N
H+ CH3
H
H Forma ionizada
CH2 CH N
CH3 H
H
Anfetamina CH2 CH N
OH- H
CH3
Forma no-ionizada
EXTRAO
(lquido-lquido)
= molcula de gua
EFEITO SALTING OUT

H
CH2 CH N
CH3 H
+ NaCl (cloreto de sdio)

H
CH2 CH N
Na+ Cl- CH3 H
EXTRAO
(fase slida)
2,5mL Amostra 3mL gua +3mL 2mL
2mL Metanol +
+ 2,5mL gua + HCl (0,1M), diclorometano/
2mL tampo PI + 2mL secagem (5min) isopropanol /
fosfato tampo fosfato + 9mL metanol NH3 (80:20:2)

BE
PI
Interf.
COC

1 2 3 4
Tipos de colunas (SPE)

-INTERAES NO-POLARES (Van der Waals)

C8
Octil Si

PH
Fenil Si

CH Si
Ciclo
hexil
Tipos de colunas (SPE)

-INTERAES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)

CN Si C N
Cianopropil
H O

NH2 H
Si NH
Aminopropil
H O

2OH
Si O O H
Diol
OH H NH
Tipos de colunas (SPE)

-INTERAES INICAS (Eletrosttica)

O
CBA C
Si O- +
cido NH3 R
carboxlico

SCX
Si
cido
benzenosulfnico SO3- +
NH3

SAX
Trimetil Si N+(CH3)3 -
SO3 R
aminopropil
EXTRAO

H + CH3
N
Forma

CH3
H+ O
C OH
ionizada
N
O
O O C
C OH
O
O C

CH3
N
Benzoilecgonina
O
-
-metablito da C O
cocana OH- O C
O Forma
ionizada
EXTRAO
(fase slida)

H + CH3
SO3- N

O
C OH
O
O C
EXTRAO POR HEAD SPACE
DETERMINAO DE VOLTEIS

Amostra (urina, seringa


sangue ou saliva)
+ sulfato de sdio
ESTUFA 70C
30 min GC
+ PI
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA

1 2 3 4 5 6
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Baseado na partio do analito entre a fibra de extrao e a matriz
(amostra)
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Fibras comercialmente disponveis:

Fase estacionria e Abreviao Aplicao geral


espessura do filme
Polidimetilsiloxano PDMS Compostos no-
(100um) polares, volteis
Polidimetilsiloxano PDMS No-polares,
(30um) volteis e semi-
volteis
Polidimetilsiloxano PDMS No-polares, semi
(7um) e no volteis
Polidimetilsiloxano- PDMS-DVB Polar
divinilbenzeno (65um)
Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral,
volteis
Carboxeno- CAR-PDMS Volteis
polidimetilsiloxano
(75um, 85um)
Carbowax- CW-DVB Polar, volteis
divinilbenzeno (65um,
75um)
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)

Fatores que afetam a eficcia de extrao por SPME:

-Dimenses da fibra (comprimento, espessura);


-Tipo de fibra;
-Temperatura de extrao;
-Efeito da matriz (presena de sal, pH);
-Velocidade de agitao;
-Tempo de extrao.
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Influncia do tempo de extrao:
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Influncia da temperatura de extrao:
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Influncia da concentrao de sal:
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)
-Influncia do pH:
MICRO EXTRAO EM FASE SLIDA (SPME)

Vantagens da SPME sobre a SPE e


extrao lquido-lquido:

-simplicidade
-prtico
-rpido
-extrao sem utilizao de solventes
-pode ser automatizado.
4) Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivao
Objetivo:
-melhorar as condies cromatogrficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivao
Ex. opiceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condies
cromatogrficas (GC)
N.CH3
N.CH3
H BSTFA
H
H 70C 20 H
min
CH3 CH3
CH3 Si O O O Si CH3
HO O OH
CH3 CH3
-Derivao
Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade
para detectores ECD

CH3 CH3
N PFP/PFPA N

O
O 70C 20 C O CH2CF2CF3
C O H
min O
O O C
O C
MATRIZES BIOLGICAS
URINA
SANGUE
AR EXALADO

MATRIZES ALTERNATIVAS:
SALIVA
CABELO
MECNIO
UNHA
SUOR
URINA
Nfron
URINA
CARACTERSTICAS:

Coleta no invasiva
Disponibilidade de grandes volumes de
amostra
Concentrao alta
Facilidade da anlise (baixo custo)
Possibilidade de adulterao da amostra
Perodo de deteco: alguns dias
Deteco de uso eventual
SANGUE
CARACTERSTICAS:

Coleta invasiva
Necessidade de profissional treinado
Matriz relativamente complexa
Perodo de deteco: algumas horas
Correlao com estado clnico
Maior dificuldade de adulterao
SALIVA
SALIVA
CARACTERSTICAS:

Coleta no-invasiva
Facilidade na coleta
Coleta sob vigilncia e em campo aberto
Correlao com concentrao sangnea
Perodo de deteco: algumas horas
Pouco volume de amostra
Concentrao baixa
CABELO
CARACTERSTICAS:

Coleta no-invasiva
Perodo de deteco: meses
Retrospectiva e cronolgica
Deteco: uso intenso
Disponibilidade: ????
Adulterao: difcil
Possibilidade de contaminao
Baixa concentrao
Matriz complexa -dificuldade na anlise
CABELO

1 cm
2 cm
3 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
8 cm
9 cm
10 cm
MECNIO

CARACTERSTICAS:
Exposio fetal
Coleta no-invasiva
Matriz complexa -dificuldade na anlise
Perodo de deteco: meses
Disponibilidade
Possibilidade de contaminao
UNHA
UNHA

CARACTERSTICAS:
Coleta no-invasiva
Baixa concentrao
Dificuldade na anlise
Perodo de deteco: meses
Uso intenso
Disponibilidade????
Adulterao: difcil
Possibilidade de contaminao
SUOR

CARACTERSTICAS:

Coleta no-invasiva
Coleta atravs de adesivos patch
Baixa concentrao
Dificuldade na anlise
No existem muitos estudos
Monitorar pacientes em tratamento
Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivao
Objetivo:
-melhorar as condies cromatogrficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivao
Ex. opiceos
Aumento da volatilidade
(melhora das condies
cromatogrficas (GC)
N.CH3
N.CH3
H BSTFA
H
H 70C 20 H
min
CH3 CH3
CH3 Si O O O Si CH3
HO O OH
CH3 CH3
-Derivao
Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade
para detectores ECD

CH3 CH3
N PFP/PFPA N

O
O 70C 20 C O CH2CF2CF3
C O H
min O
O O C
O C
Tcnicas de extrao e deteco em amostras biolgicas de acordo com a

estrutura qumica das molculas


D
E
R
I
V
A