SELECCIN Y VALIDACIN DE

REFERENCIA GEN POR GEN ,ANLISIS

DE EXPRESIN EN SWITCHGRASS
(PANICUM VIRGATUM)
USO CUANTITATIVO DE LA RT-PCR EN
TIEMPO REAL
Jacinta Gimeno, Nicholas Eattock, Allen Van Deynze, Eduardo Blumwald*
Department of Plant Sciences, University of California Davis, Davis, California, United States of
America
Gentica Molecular 2017-1

Mara Alejandra Martnez

Fabin Camilo Forero
 Panicum virgatum
planta perenne de Pasto nativo de Amrica
del Norte , de tipo C4. Usada Inicialmente
como cultivo forrajero, actualmente se est
usando como materia prima de
biocombustible celulsico dedicada en el
medio Sureste de los Estados Unidos, ya que
se ha demostrado que Producen un 540% ms
de energa renovable que la energa
consumida en Su produccin y tiene
importantes beneficios medioambientales La
conservacin del suelo y las bajas emisiones
de gases de efecto invernadero .
P. virgatum como fuente de
bioenerga

A partir de Celulosa

Etanol
 OBJETIVOS
Probar La estabilidad de expresin de estos Candidatos de genes de referencia
en diferentes tejidos Y en diferentes condiciones de estrs utilizando geNorm y
NormFinder.

Realizar un anlisis detallado de la expresin de de la familia de genes de la

celulosa sintasa en Switchgrass (SGCesAs), como un ejemplo para los genes
involucrados en Biosntesis de celulosa.

Definir el patrn de su expresin en Diferentes tejidos y bajo diferentes

condiciones de estrs para Su utilizacin con el fin de mejorar la produccin de
celulosa en Cultivos de energa , principalmente de etanol celulsico.

ilustrar la Utilidad de los genes de referencia ms estables identificados en este

Trabajo,utilizando genes de referencia para la normalizacin de la expresin. Por
lo tanto, este estudio Proporciona directrices tiles y punto de partida para el gen
de referencia Para el anlisis de expresin usando tcnicas de qRT-PCR en
P.virgatum.
La PCR cuantitativa en tiempo real (qRTPCR) ,Ha surgido como una tcnica
importante para estudiar el anlisis de la expresin gnica. Para obtener resultados
precisos y fiables, La normalizacin de los datos con genes de referencia es
esencial

En este trabajo, se evala la estabilidad de la expresin de los genes a utilizar

Como referencia para qRT-PCR en la hierba P. virgatum. Once genes de referencia
candidatos, incluyendo eEF-1a, UBQ6, ACT12, TUB6, EIF-4a, GAPDH, SAMDC, TUA6,
CYP5, U2AF y FTSH4, fueron validados para la normalizacin de qRT-PCR en
diferentes tejidos vegetales y Bajo diferentes condiciones de estrs. La estabilidad
de la expresin de estos genes se verific mediante el uso de dos algoritmos
distintos, GeNorm y NormFinder.
Genes de Referencia

1. eEF-1a factor de Elongacin

2. UBQ6 Ubiquitina-6
3. ACT12 Actina 12
4. TUB6 Tubulina 6
5. EiF4a Factor de Iniciacin eucariotico 4a
6. GAPDH Gliceraldehido- 3fosfato deshidrogenasa1
7. SAMDC 5- adenosil metionina descarboxilasa
8. TUA6 4-Tubulina 6
9. CYP5 Ciclofilina 5
10.U2AF Factor de empalme
11.FTSH4 Proteasa-4
 Metodologa
Tratamientos de estrs y recoleccin de tejidos

Se recogieron muestras de diferentes tejidos y Diferentes condiciones de estrs. Tejido de hojas,

tallos, raquis y Las races fueron recogidas de las plantas viejas de tres meses que crecen bajo
condiciones well-watered.(Bien regado)

Aislamiento total de ARN y sntesis de Cdna Seleccin de genes de referencia candidatos,diseo de

cebadores Y validacin

EST de GenBank de switchgrass. EST

seleccionadas Se utilizaron para consultar
utilizando el Parmetros por defecto para un ensayo de la base de datos de protenas no
PCR en tiempo real. Longitudes del amplicn Variaron de redundantes utilizando BLASTX para
90 a 100 pb, las temperaturas de fusin estaban entre 58 - verificacin de identidad.
60uC y longitudes de cebador entre 18-24 pb
Seleccin de genes de referencia candidatos, diseo de cebadores Y
validacin

Los genes utilizados son: Os01g54620,

Os03g59340, Os07g10770,Os05g08370,
Os07g24190, Os03g62090, Os07g14850,
Os09g25490, Os10g32980 y Os06g39970.

Desarrollo de cebadores especficos para

genes CesA en Switchgrass

Anlisis de la estabilidad de la
Anlisis RT-PCR en tiempo real expresin gnica de referencia

Las reacciones de PCR se realizaron bajo Las siguientes

condiciones: 10 min a 95uC y 40 ciclos del uno
Ciclo de 3 s a 95 uC y 30 s a 60 uC en un pozo de 96 pocillos
Placa de reaccin. La especificidad de las reacciones de
PCR se verific por fusin Anlisis de curva de cada producto
amplificado de muestra
 RESULTADOS

La seleccin de los
genes de referencia
candidatos en P.
virgatum, Diseo del
primer y especificidad
de la amplificacin
 Anlisis de estabilidad de expresin

Los genes U2AF y FTSH4 tuvieron la mayor estabilidad de

expresin en Muestras bajo condiciones de estrs abitico y
una vez ms, SAMDC Fue el gen menos estable. Cuando
slo se Consideradas, UBQ6 y CYP5 fueron los mejores
candidatos para Normalizacin y en el subconjunto de
muestras compuestas por muestras De las hojas y tallos los
genes ms estables fueron ACT12 y CYP5 mientras que en
ambos casos, TUB6 fue el peor gen

Factor de empalme U2AF 65

U2 factor de auxiliar ( U2AF ), compuesto de una grande y una pequea kDa de la subunidad es una
subunidad, es una protena no-snRNP requerido para la unin de U2 snRNP a la protena que en los humanos
rama sitio pre-mRNA. Este gen codifica la subunidad grande U2AF, que est codificada por el U2AF2
contiene una regin de unin a ARN especfica de secuencia con 3 ARN gen
motivos de reconocimiento y un Ser-dominio rico en Arg / necesario para el
empalme
 Validacin de genes de referencia por cuantificacin de
SGCesAsPerfil de expresin con diferentes factores de
normalizacin

Nota: Los genes se clasifican segn sus valores de estabilidad de los genes ms estables
a los menos estables.
 . Valores de
estabilidad de
expresin gnica
(M) y variacin
en pares (V) de
los genes de
referencia
candidatos
calculados por
geNorm.

Clasificacin de la estabilidad de la expresin gnica realizada en todas las muestras,

muestras de estrs abitico, muestras de tejido y muestras de hojas y tallos.
Los genes menos estables estn en la izquierda y los genes ms estables a la derecha.
 Se analiz la variacin en pares (Vn / Vn + 1) entre los factores de
normalizacin
NFn y NFn + 1. Asterisco indica el nmero ptimo de genes de referencia
necesarios para la normalizacin
 DISCUSIN

Figura 4. Cuantificacin relativa de genes SGCesAs

utilizando diferentes combinaciones de genes de
referencia para la normalizacin.
Cuantificacin relativa de genes SGCesAs utilizando diferentes
combinaciones de genes de referencia para la normalizacin. A. gen
Expresin normalizada con la mejor combinacin de genes de referencia
seleccionados por NormFinder para todo el conjunto de muestras en
estudio. B. Expresin gnica Normalizado con la mejor combinacin de
genes de referencia seleccionados por NormFinder para muestras de
tejido. C. La expresin gnica normalizada con los mejores Combinacin
de genes de referencia seleccionados por NormFinder para muestras bajo
estrs abitico. D. La expresin gnica se normaliz con la expresin ms
estable Genes de referencia seleccionados por geNorm para todas las
muestras en estudio. E. La expresin gnica normalizada con los genes de
referencia ms estables seleccionados por GeNorm para muestras de
tejido. F. La expresin gnica se normaliz con los genes de referencia ms
estables seleccionados por geNorm para muestras bajo estrs abitico. G.
La expresin gnica normalizada con los genes menos estables identifican
por ambos algoritmos para todas las muestras en estudio. H. Expresin
gnica normalizada Con los genes menos estables identifican por ambos
algoritmos para muestras de tejido. I. La expresin gnica normalizada con
los genes menos estables identificados por ambos Algoritmos para
muestras bajo estrs abitico.
Aunque la clasificacin de los diferentes genes de referencia Por ambos programas es
similar, pero varian entre ellos :

Para muestras de tejido, geNorm Recomend el uso de UBQ6 y

CYP5 y NormFinder Recomienda eEF-1a y ACT12.

Para hojas muestras de plantas Bajo condiciones de estrs abitico

CYP5 y FTHS4 fueron seleccionados por GeNorm y U2AF y FTHS4
para normFinder.

Para todo el conjunto de Muestras en estudio, eEF-1a y ACT12, se

determinaron por NormFinder y UBQ6, CYP5 y eIF-4a por geNorm.
 CONCLUSIN

El uso de los genes de referencia seleccionados por ambos Programas GeNorm

y Normfinder ,para determinar el perfil de expresin de los genes , permiti
determinar la combinacin ms adecuada de control Genes EST. Estos
resultados pueden constituir un punto de partida para seleccionar Genes de
referencia en el futuro a una normalizacin ms Otros tejidos y bajo otras
condiciones experimentales en Panicum virgatum .
 BIBLIOGRAFA

Gimeno J, Eattock N, Van Deynze A, Blumwald E (2014) Selection and

Validation of Reference Genes for Gene Expression Analysis in Switchgrass
(Panicum virgatum) Using Quantitative Real-Time RT-PCR. PLoS ONE 9(3):
e91474. doi:10.1371/journal.pone.0091474.