CITOMETRIA DE FLUJO

Dr. Julio lvarez Endara

Hematologo-hemoterapeuta
Master de Medicina transfusional
Especialista en gestin de calidad.
 CITOMETRIA DE FLUJO
La citometra de flujo es una tecnologa biofsica basada
en la utilizacin de luz lser, empleada en el recuento y
clasificacin de clulas segn sus caractersticas
morfolgicas, presencia de biomarcadores, y en la
ingeniera de protenas.

500 a 4000 clulas por segundo.

El nombre original de la citometra de flujo era

"citofotometra de pulso" (en Alemn:
Impulszytophotometrie).
 Fluidos.
ptica , una fuente de excitacin y un sistema coleccin para
generar y recoger las seales luminosas.
El sistema de coleccin consiste en espejos pticos y filtros para
encaminar determinadas longitudes de onda.

Electrnica, para convertir las seales pticas en seales

electrnicas proporcionales y digitalizarlas para anlisis
computacional.

SISTEMA OPTICO: Lser : Argn con luz monocromtica de

488nm , filtros , lentes y detectores.

SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa

en seales elctricas y las procesa para su anlisis
 HISTORIA
El primer citmetro de flujo basado en la medicin de
impedancia, es decir utilizando el principio Coulter, fue
descrito en la patente de Estados Unidos expedida en
1953 a nombre de Wallace H. Coulter.

Mack Fulwyler fue el inventor del precursor de los

citmetros de flujo actuales, en particular del tipo
separador de clulas.
El primer dispositivo de citometra de flujo basado en
fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por
Wolfgang Ghde
 Reinherz (1975) emplea la tecnologa de los anticuerpos monoclonales
de Kholer y Milstein para identificar subpoblaciones celulares en
funcin de antgenos de superficie.

Loken (1977) mide simultneamente dos antgenos celulares con un

solo lser, emplea la compensacin electrnica de la seal entre
isotiocianato de fluorescena (FITC) y la tetralmetilrodamina.

Oi (1982) introduce las ficobiliprotenas como flourocromos

(ficoeritrina).

Entre 1979-80 varios autores describen tcnicas citomtricas para

medir condiciones fisiolgicas:Visser (pH intracelular), Valet (carga de
superficie), y Thorell (estado red-ox).

Gray (1975) realiza el cariotipo por citometra de flujo. Este

procedimiento fue posteriormente mejorado por Carrano.
 PRINCIPIO
Un rayo de luz monocromtico, usualmente de luz lser, es dirigido
hacia un finsimo chorro de lquido hidrodinmicamente enfocado.

Detectores en el punto en el que el chorro de lquido atraviesa el

rayo de luz. Uno se coloca en lnea con el rayo de luz (a este
detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector
de Dispersin Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del
rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o
detectores de Dispersin Lateral).

El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen

de la partcula, mientras que los detectores laterales o SSC brindan
informacin acerca de la complejidad interna .
Unin de sitios especficos con anticuerpos marcados con fluorocromos
El fluorocromo absorbe energa del lser
El fluorocromo libera energa absorbida por :
Vibracin y disipacin del calor.
Emisin de fotones a una mayor longitud de onda llamada fluorescencia

Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de

Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.
Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst,
DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente
.
 Biologa molecular, inmunologa,
En biologa marina.
En ingeniera de protenas, se utiliza la
citometra de flujo en conjuncin con
tcnicas de expresin en levaduras y
expresin en bacterias.
 En color cian se
observa la poblacin
de neutrfilos +
basfilos, en
magenta la de
linfocitos, en verde
monocitos, en rojo la
de eosinfilos y por
debajo las plaquetas
y eritrocitos fantasma
 CITOMETROS DE FLUJO
Un sistema de medicin,
Un sistema de iluminacin formado ya sea por lmparas
de alta luminosidad (de mercurio, xenn) lseres de alta
potencia refrigerados por agua
Un detector y un conversor de seales ADC (anlogo a
digital), los cuales registran la seal producida (sea FSC,
SSC, SFL)
Un sistema de amplificacin, lineal o logartmico.
Un ordenador para el anlisis de las seales
 ANTIGENOS DE
DIFERENCIACION.
Desarrollo de anticuerpos monoclonales.
Proteinas de superficie.
CD.( cluster of differentiation).
160 protenas.
BCR,TCR,HLA reconocimiento especifico
de antgenos del sistema inmune.
 .

Major different types of surface proteins

with respect to how they integrate into
.

Major different types of surface proteins with respect to how they integrate
into
LEUCEMIA
 LINFOIDE

85 % de los casos son estirpe B.

No son factores de riesgo independiente.
LLA T: se asocia con mayor edad, mayor
numero de leucocitos, peor respuesta.
LLA pre T, 15 % inmunofenotipo muy
inmaduro, mala respuesta.
 Leucemias linfoblsticas inmunofenotipaje

Estirpe B
pro-B HLA-DR+/TdT+/CD19+

comn HLA-DR+/TdT+/CD19+/CD10+

pre-B HLA-DR+/CD19+/CD10+/CD20+/Igc+

B HLA-DR+/CD19+/CD10+/CD20+/IgS+

Estirpe T
pro-T CD7+
pre-T CD7+/CD5+

cortical CD7+/CD5+/CD1+/CD3+/CD4+CD8+

T CD7+/CD5+/CD3+/CD4+ o CD8 +
MIELOIDE