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Introduction la cristallographie

des macromolcules biologiques


La connaissance de la structure 3D est rvolutionnaire pour ltude
du vivant
Cest souvent une interprtation directe

La structure:
-Informations prcise sur le repliement
-dtermination des interactions
protine-protine, protines-substrat, protines-cofacteur,
-Mcanisme catalytique, reconnaissance molculaire
-Rvle les liens fonctionnels et volutifs
-Base pour les biotechnologies
Inhibiteurs, mdicaments, mutants

Il faut intgrer les informations structurale avec les informations de gntiques,


biochimie, biologie cellulaire, biologie molculaire, bioinformatique

La biologie structurale : le microscope moderne


Biologie structurale

La dtermination des relations existant entre la structure et la fonction des


macromolcules biologiques constitue une tape essentielle la comprhension
des mcanismes biologiques.

Ne dans les annes 50, avec la rsolution de la structure tridimensionnelle de


l'hmoglobine et de myoglobine et la dtermination de la structure en double
hlice de l'ADN, la biologie structurale est maintenant devenue une discipline
incontournable dans les sciences du vivant. Depuis son avnement, la biologie
structurale repose sur une combinaison de mthodes biologiques, chimiques,
physiques et de calcul.

Au cours des dernires dcennies, elle a intgr de nombreuses perces


technologiques ralises dans ces diffrentes disciplines .
La dtermination de la structure 3D des macromolcules ncessite
d'importants moyens biochimiques pour la production, la purification et la
cristallisation des protines ainsi que des instruments complexes et lourds
pour l'obtention des donnes de diffraction aux rayons X (Synchrotrons).

De gros moyens informatiques sont galement ncessaires pour la rsolution


des structures.

Le processus exprimental pour l'laboration d'une structure 3D est rsum


l'aide du graphique suivant:
Plan

Le contexte: question de taille

Les bases thoriques de la cristallographie

La procdure: du cristal la structure


cristallogense, acquisition des donnes,
rsolution de la structure, affinement, validation
Le contexte:
question de taille

Cellule animale Protines Phenylalanine

~5 m = 5 x 10-3 nm ~5 nm = 50 A ~1 nm =10A

Pour tudier la structure de macromolcules avec un systme optique, il faut disposer


d'une source de rayonnement compatible avec la rsolution atteindre.

Pour pouvoir rsoudre des atomes, le rayonnement doit avoir une longueur d'onde du
mme ordre de grandeur que les distances interatomiques, c'est dire de l'ordre de
1,5A.
Les chantillons biologiques sont de tailles varies
La biologie structurale est un processus complexe et interdisciplinaire
Techniques de dtermination
de la structure des macromolcules

tat solide

Cristallographie toutes les tailles


structure au niveau atomique

Solution
RMN jusqu ~ 30 kDa
arrangement spatial, dynamique

de 10 kDa ~ 300 kDa


SAXS structure globale, basse rsolution
Small Angle X-ray Scattering

Microscopie lectronique partir de ~300 kDa


structure globale, basse rsolution
Les diffrentes techniques

Radiocristallographie
principe: interaction RX matire
Avantages: positions prcises des atomes, pas de limite de taille
(ex ribosome). PFOR (2PDA)
Inconvnients: cristal, problme de la phase, atomes
dhydrogne difficiles voir

RMN
principe: Interaction des spins des noyaux dans un champs
magntique. Information sur lenvironnement de chaque noyau.
Avantages: En solution, Information sur la dynamique de la
macromolcule. Prion humain (1HJN)
Inconvnients: Limitation de taille (30kDa avec marquage),
moins prcise que la cristallographie, solution concentre

Microscopie lectronique
principe: interaction lectron matire
Avantages: Pas de problme de phases (lentille)
pas de limite de taille (ex virus). structure globale
Inconvnients: basse rsolution, dommage sur lchantillon

Virus coxsachie Cav21


Diffusion des rayon X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS)
principe: interaction RX matire
Avantages: chantillon en solution, pas de cristal
Inconvnients: basse rsolution

the modular cellulase Cel48F


Neutrons (complment la radiocristallographie) from Clostridium cellulolyticum
principe: interaction neutrons matire
Avantages: les atomes dhydrogne sont visibles
Inconvnients: Gros cristaux

Bioinformatique (en trs fort progrs)


Principe: modlisation in silico,
Avantages: peu chre, rapide
inconvnients: prcision, qualit des rsultats

Chimie-physique
principe: marquage, spectroscopie, biochimie,
Avantage: Informations
Inconvnients: Mesure indirecte, interprtation
Dichrosme circulaire

Aucune technique nest complte


tout est bon prendre
Plan

Le contexte: question de taille

Les bases thoriques de la cristallographie

La procdure: du cristal la structure


cristallogense, acquisition des donnes,
rsolution de la structure, affinement, validation
Ltat cristallin

Un cristal est un solide polydrique, plus ou moins brillant, structure rgulire


et priodique, forme d'un empilement ordonn d'un grand nombre d'atomes, de
molcules ou d'ions.
Symtrie
Symtrie

Les macromolcules biologiques sont chirales.


Il ny a pas dimage miroir naturelle.
Seulement un nombre limit doprations donne
des cristaux (65 des 230 groupes despace possibles)
Principe :
Soumettre le systme une excitation
et tudier ses ractions

Signaux mis par


Systme tudier le systme sous leffet
e.g. solution aqueuse, de la sonde
cristal e.g. Transmission

Sonde Diffusion grands angles


e.g. faisceau de lumire

Rayons IR : Spectro Infra rouge

Champ radiofrquence Contiennent de linformation


+ champ magntique : RMN sur les caractristiques du
systme
Ionisation +
champs E et B : spectro de masse

Rayons X : diffraction X
Neutrons, lectrons
Etapes en biocristallographie
Gne dintrt
Sources de rayons X, dtecteurs,
Collecte et intgration des donnes

Expression
purification cristallisation diffraction

Echantillon
biologique Structure de complexes phasage

Biologie molculaire Interprtation


biologique modlisation

Bioinformatique
Biotechnologies Autres informations

2 tapes limitantes: cristallisation et phasage


La purification de la macromolcule.

Lobtention de cristaux ncessite de disposer de plusieurs milligrammes


dune macromolcule ltat soluble (5-10 mg), et avec une trs grande
puret (>98%).

Vrifier systmatiquement la qualit du lot:


Gel SDS, coloration argentique
activit
La cristallisation

Obtenir un maximum dinformations sur la stabilit de lchantillon.


Connatre les conditions de cristallisations des protines voisines.

Deux techniques de cristallisation sont principalement utilises en cristallographie


biologique:

1-la diffusion de vapeur: elle peut se faire par vaporation de solvant ou change de
solvant contre un rservoir plus concentr, ou change de solut volatil.

2-la diffusion de liquide: ralise soit directement par une interface liquide-liquide, soit
laide dune membrane dialyse ou de gels.
La technique la plus utilise: La diffusion en phase vapeur
La diffusion en phase vapeur

Paramtres varier

Nature du prcipitant
Sels, polymres (PEG), solvants organiques.

Force ionique

pH
Concentration de la protine
Temprature

Additifs
nature du cation/anion, solvant (alcool, dtergent), substrats, Cofacteurs.
Automatisation: robots
Cristaux. . .
Remarque:

Les cristaux sont trs fragiles, il faut les garder sous atmosphre hydrate.
Dnaturation par lirradiation.
La diffraction

Rayons X
Neutrons

Transforme de Fourrier

Il faut que le cristal diffracte bien (rsolution + monocristal)


La cristallographie aux rayons X ou diffractomtrie de rayons X (DRX, on
utilise aussi souvent l'abrviation anglaise XRD pour X-ray diffraction) est une
technique d'analyse fonde sur la diffraction des rayons X sur la matire.

La diffraction n'ayant lieu que sur la matire cristalline, on parle aussi


de radiocristallographie.

Pour les matriaux non-cristallins, on parle de diffusion. La diffraction fait partie


des mthodes de diffusion lastique.

Cette mthode utilise un faisceau de rayons X qui rencontre le cristal


provoquant la dispersion du faisceau lumineux dans des directions
spcifiques. Par la mesure des angles et de l'intensit des rayons rfracts, il est
possible d'obtenir une image tridimensionnelle de la densit lectronique dans
le cristal. partir de cette densit, la position moyenne des atomes du cristal
peut tre dtermine, ainsi que leurs liaisons chimiques, leur entropie et
d'autres informations.

L'appareil de mesure s'appelle un diffractomtre.


Les donnes collectes forment
le diagramme de diffraction ou diffractogramme.
Exemple de diffractogramme
de poudre
Dtermination des structures cristallographiques
1- partir des intensits diffractes et de la relation inverse (rseau
rciproque-rseau rel cest--dire les directions de diffraction), il est
possible, partir d'une srie d'images de diffraction sur un monocristal, de
dterminer l'arrangement tridimensionnel des atomes d'une structure
cristalline.
2- Cette mthode a pris une importance considrable ces dernires
annes pour la dtermination de la structure des protines biologiques

3- On part de figure de diffraction sur monocristal (clichs de Lau). l'aide


d'un logiciel (par exemple Denzo ou XDS), il est possible de dterminer
les axes et centres de symtrie d'un cristal et de proposer le systme
cristallin le plus probable parmi les sept existants (triclinique,
monoclinique, orthorhombique, trigonal, ttragonal=quadratique, hexagonal,
cubique). C'est ensuite l'utilisateur de choisir le groupe d'espace le plus
appropri : le systme choisi est gnralement celui qui a la plus haute
symtrie afin d'avoir la meilleure rsolution (c'est gnralement la fin de
l'analyse, lorsque toutes les positions atomiques sont dtermines que peut
tre prcis le groupe d'espace). Des paramtres de maille sont alors
proposs
Le facteur de fiabilit R (reliability) permet de calculer le
degr de fiabilit de la maille propose par rapport la
structure cristalline relle. Quand il atteint une valeur
suffisamment faible cela signifie que le modle de
maille est acceptable; on peut alors passer l'tape
suivante,

c'est--dire l'intgration des intensits diffractes et


l'affinement des paramtres de maille.
- Les amplitudes diffractes sont caractristiques de la nature et de la
position des atomes, en fait de la densit lectronique en tout point de
la maille. Plus exactement, espace rel (de la structure cristalline) et
rciproque (des directions de diffraction) sont lis par transformation de
Fourier.

Malheureusement, une partie importante de l'information est perdue -


lors de la collection des images de diffraction, puisque seule la
norme des intensits complexes est mesurable par les dtecteurs.

- Les phases, qui portent une part trs importante de l'information -


structurale, sont perdues et doivent tre dtermines
(exprimentalement et/ou informatiquement).

Il est ncessaire d'intgrer un grand nombre de taches , -


correspondant l'intensit des rflexions sur le rseau cristallin.
Pour les petits composs (mailles contenant peu
d'atomes), des procdures classiques ont t mises
au point.

Par contre, pour des composs de masse molaire


plus importante, on utilise des mthodes :

1- De drivation aux atomes lourds ;

2- Anomales ;

ou bien de
3- Remplacement molculaire, quand la structure
(de l'unit asymtrique) est partiellement connue.
La transforme de Fourier

Une srie de Fourier est une srie de fonctions


sinusodales obtenue en analysant le "spectre en
frquences" d'une fonction priodique dtermine

Le rseau cristallin est priodique. Joseph Fourier


Londe lectromagnetique est priodique.

Le clich de diffraction est la transforme de Fourier de la densit


lectronique de l'objet et est donc le produit des transformes de
Fourier du motif par celles du rseau.
Dfinition de la transforme de Fourrier

La transformation de Fourier associe une fonction intgrable, (dfinie sur


l'ensemble des nombres rels ou celui des nombres complexes), une fonction
appele transforme de Fourier dont la variable indpendante peut s'interprter
en physique comme la frquence ou la pulsation.

La transforme de Fourier s'exprime comme somme infinie des fonctions


trigonomtriques de toutes frquences. Une telle sommation se prsente sous
forme d'intgrale. L'analyse non standard permet de la prsenter sous forme
d'une srie et justifie le point de vue intuitif..

Lorsque la fonction est la reprsentation d'un phnomne physique, comme l'tat


du champ lectromagntique ou du champ sonore en un point, on
l'appelle signal et sa transforme de Fourier s'appelle son spectre.
Collection des donnes
Au laboratoire
A Grenoble

Anode tournante (laboratoire)

Synchrotron
ESRF Racteur neutrons
Les synchrotrons dans le monde ILL
Le phasage

Pas de lentille de qualit pour les rayons X.

Plusieurs techniques

remplacement molculaire
on utilise les phases du modle dune protine similaire (id seq >30%)

driv datome lourds (MIR)


On fixe des atomes lourds sur la protine (Hg, U, Tb, )

diffusion anomale (synchrotron)


on utilise la proprit de diffusion anomale des atomes lourds (>Fe)
Soit naturelle (ex agrgats 4Fe-4S)
Soit fix (Mir)
Soit acide amin modifi (ex Selenomethionine). (expression)

Mthodes Directes
Si rsolution atomique (< 1,2) et petite protine (<10 kDa)
Modlisation

Rayons X
Neutrons Transforme de Fourrier
En calculant la transforme de Fourier inverse
on obtient la densit lectronique de la molcule

On place les
atomes
dans la densit
lectronique

Il faut connatre la
squence
Notion de rsolution
Plus la rsolution est grande plus on pourra voir des dtails fins

d=4

Difficile de construire le modle


d=3

On commence reconnaitre les acides amins


d=2

A cette rsolution on peut voir les molcules deau


d=1

Rsolution atomique
On voit chaque atome sparment
Interprtation Biologique

Structure
+
complexe

Mcanisme catalytique
50 proteins and 3 large RNAs 300 000 atoms !!
Conformation vs. function

Different conformations of the protein


can have different functions

Native state vs. functional state

Protein activation

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