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OUTILS DE GENIE

GENETIQUE
Gnie gntique

Ensemble des techniques de manipulation


du matriel gntique (ADN, ARN) des
fins pratiques pour utiliser, reproduire,
ou modifier le gnome des tres vivants
Le code gntique est le mme pour tous
les tres vivants

Un mme gne donnera toujours la mme


protine, peu importe l'espce de
l'individu

On peut introduire un gne d'une espce


dans une autre espce = gnie gntique
Connaissances permettant de transfrer du matriel
gntique dun organisme un autre

ADN recombinant (ou recombin)


ADN hybride obtenu in vitro par combinaison de
deux molcules dADN appartenant deux
espces diffrentes
Les plasmides

Petites molcules dADN double brin, circulaires


A localisation extrachromosomique
Prsents chez la plupart des espces bactriennes
A rplication autonome (=rplicons) indpendamment
des chromosomes

Chromosome bactrien
circulaire Plasmides

Bactrie
L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un
organisme donneur et celui dun vecteur (qui peut tre d'une espce
totalement diffrente)

ORGANISME DONNEUR : VECTEUR


Extraction d'un fragment (fragment d'ADN capable de
d'ADN d'intrt rplication autonome)
Ex: gne associ une maladie LADN dans lequel on insre lADN
LADN insr est appel insert , tudier et qui sert de support
ADN exogne ou ADN tranger

Insertion du fragment d'intrt dans le vecteur

Obtention d'un ADN Recombinant

Amplification de cet ADN, expression des


protines correspondantes...
On extrait les plasmides de bactries

Une enzyme ouvre les


plasmides

On extrait ou on
synthtise le On mlange des copies du gne et
gne greffer des plasmides. Une enzyme
fusionne les brins d'ADN

Les plasmides sont rintroduits


dans des bactries

Le gne est reproduit quand la


bactrie se reproduit
Applications pratiques

Thrapie gnique

Vise remplacer ou complmenter un allle


mutant dfectueux par un allle fonctionnel
A surexprim une protine dont l'activit
aurait un impact thrapeutique (Production de
protines dintrt mdical)
Vaccins
Applications pratiques

Plantes transgniques

Plantes rsistantes aux insectes


Rsistantes aux herbicides
Fruits et lgumes qui se conservent plus
longtemps
Nouvelles saveurs
Plantes plus riches en certains lments
nutritifs (vitamines)
Applications pratiques

Animaux transgniques
Animaux croissance plus rapide
Plus faibles en gras
Plus productifs (en lait, en viande, en ufs)
Production de protines usage
pharmaceutique (ex: insuline)

DANGERS ?????
Pour la sant ?
Pour l'environnement ?
Les enzymes en gnie gntique
1- Les nuclases

les nuclases dgradent les molcules d'ADN


en rompant les liaisons phosphodiesters
liant un nuclotide au suivant
Il existe 2 types de nuclases
Les exonuclases coupent aux extrmits
les endonuclases coupent des liaisons internes
1-1- Exonuclases

Ces enzymes liminent des nuclotides un un


partir dune extrmit de lADN
Dans le sens 5 vers 3ou l'inverse

Ex: Exonuclase III catalyse lhydrolyse


squentielle des nuclotides dun ADN partir
dune extrmit 3 libre (dans le sens 3 vers 5)
1-2- Endonuclases
A clivages non spcifiques
Ces enzymes sont capables de rompre des
liaisons phosphodiesters internes

- La DNase extraite du pancras


Coupe prfrentiellement aprs une base
pyrimidique
- La nuclase S1
Isole dun champignon, Aspergillus oryzae
Dgrade seulement les acides nucliques
monocatnaires
A clivages non spcifiques
Enzymes de restriction
Molcules extraites partir de microorganismes
(gnralement des bactries) et qui coupent les
liaisons phosphodiesters au niveau des acides
nucliques
Enzymes de restriction

Fabriques par les bactries

Protgent les bactries contre linvasion par de lADN


tranger quelles coupent en petits morceaux

Reconnaissent des squences spcifiques de 4 8


nuclotides

Coupent lADN sur ces sites dfinis (sites de restriction)

Crent des bouts qui sont complmentaires

La taille des fragments dADN produits dpend de la


distribution des sites de restriction
Sites de restrictions ?

Sites spcifiques de nature palindromique


La lecture des deux brins complmentaires
dans des sens opposs donne la mme
squence

5 ATGCTAGCTAGCAT 3
3 TACGATCGATCGTA 5
Les enzymes de restriction peuvent couper en faisant des
extrmits franches (mme taille d'ADN sur chaque brin), ou
des extrmits cohsives (5' sortantes, ou 3' sortantes)
Ces enzymes de restriction sont classs en fonction de
leur site de reconnaissance et leur lieu de coupure
quoi servent les enzymes de restriction ?
couper l ADN des squences spcifiques
Crent des extrmits, pouvant s apparier et tre
relis par la ligase

Comment peut-on amplifier un gne ?


Par clonage dans des bactries qui se multiplient
(Amplifient lADN (in vivo))
Par PCR (Enzymes amplifient lADN (in vitro))

Quelle est lutilit de lamplification ?


Obtenir un trs grand nombre de molcules
identiques (gnes) pour pouvoir en tudier la
fonction
2- Ligase
Il est possible d'assembler deux
fragments d'ADN avec
l'utilisation d'une ligase
Catalyse la formation d'une liaison
phosphodiester entre deux
segments d'ADN
2-1- ADN ligase
L'enzyme n'agit que si les 2 ADN
sont associs par des
extrmits cohsives
2-2- T4 ADN ligase
Elle est capable d'effectuer des
ligations entre 2 ADN a bouts
francs
Ex: Insrer une squence d'ADN dans
un plasmide pour gnrer un vecteur
d'expression
3- Les enzymes modifiant lADN:
De nombreuses enzymes modifient l'ADN par
addition ou suppression de groupes chimiques
spcifiques

3-1- Les phosphatases


Catalysent llimination dun groupement phosphate en
5 Empchant donc la formation de liaison
phosphodiester (empche toute action des ligases)

Ex: Dphosphoryler un vecteur que lon vient douvrir par un


enzyme de restriction, afin dviter une refermeture de ce
vecteur (auto-ligation) qui empcherait alors dinsrer le
fragment dADN tudier
3-2- les kinases

Les kinases permettent le transfert dun


groupement phosphate partir dune
molcule dATP

Il sagit du phosphate en position gamma


(le plus externe des trois groupements
fixs sur lAdnosine). Il sera transfr
lextrmit 5 dun ADN dphosphoryl
4- Les polymrases et enzymes apparentes

Les polymrases d'acides nucliques sont des


enzymes qui synthtisent un nouveau brin
d'ADN complmentaire a une matrice d'ADN
ou ARN, seffectue de manire
complmentaire et antiparallle

Laddition des nouveaux nuclotides se faisant


dans le sens 5 P vers 3 OH
4-1- LADN polymrase I

Extraite d'Escherichia coli, elle joue un rle


majeur dans la rparation de l'ADN
Est constitue dune seule chane peptidique et
possde trois activits enzymatiques :
-Une activit de synthse ADN polymrase 5-3;
-Une activit de dgradation exonuclase 3-5;
-Une activit de dgradation exonuclase 5-3.
4-2- Lenzyme de Klenow
enzyme obtenu partir de lADN polymrase I do
lon a limin le petit fragment responsable de
lactivit exonuclase 5-3. Il ne reste donc plus que
les activits polymrase 5-3 et exonuclase 3-5

4-3- Les ADN polymrases thermorsistantes


La Taq polymrase Cest une ADN polymrase isole
des bactries vivant dans les sources deau chaude.
Elle agit une temprature voisine de 65c
4-4- La rtrotranscriptase (ou transcriptase reverse):
Code par les gnes pol des rtrovirus
La RT est un enzyme qui permet de fabriquer un ADNc partir dun
ARNm
Hybridation molculaire

Dsigne l'association qui peut avoir lieu entre deux acides


nucliques simples brins de squences complmentaires et qui
conduit la formation d'un double brin

Cette association s'effectue par l'tablissement de liaisons


hydrognes spcifiques : deux liaisons entre l'adnine (A) et la
thymine (T) (ou l'uracile U) et trois entre la cytosine (C) et la
guanine (G)

L'hybridation est la base de nombreuses techniques de biologie


molculaire impliquant la mise en prsence d'au moins deux brins
simples d'acides nucliques dans des conditions physico
chimiques prcises
Les sondes nuclotidiques

Une sonde nuclotidique est un segment de nuclotides


qui permet de rechercher de manire spcifique un
fragment d'acide nuclique que l'on dsire tudier
Cette raction sonde-fragment correspond une
raction d'hybridation molculaire
Une sonde nuclotidique peut tre une squence d'ADN
ou d'ARN, mais obligatoirement monobrin
Sa taille est trs variable : oligonuclotide de 20-30
nuclotides ou l'oppos de plusieurs centaines de
nuclotides
La sonde est complmentaire et antiparallle du
fragment recherch. Dans un mlange complexe o
s'effectue l'hybridation molculaire, la sonde doit
tre facilement reprable grce un marquage avec
un radioisotope
Les vecteurs
Un vecteur est un transporteur capable de conduire
une molcule pntrer dans une cellule

En biologie molculaire, certains vecteurs sont


tudis pour faire entrer un acide nuclique dans
une cellule et permettre la rplication ou lexpression
de cet acide nuclique dans la cellule qui le reoit

Les plasmides bactriens, les bactriophages et de


nombreux virus sont des vecteurs naturels.

Dautres vecteurs encore plus performants ont t


obtenus artificiellement partir de ceux-l grce
des manipulations gntiques