Hinchazn tarda en quesos madurados

II Congreso Internacional de Derivados Lcteos

Cajamarca Per

Unidad de Tecnologa de los Alimentos

Stella Reginensi
stellareginensi@gmail.com Noviembre 2017
 ID. 164

Identificacin genotpica de especies del gnero Clostridium

responsables de la hinchazn tarda de quesos duros y
semiduros, y caracterizacin de su dinmica estacional en
plantas lcteas
 Participantes en el proyecto financiado por CSIC I+D
2012
UTA-Facultad de Agronoma Empresas.
Stella Reginensi Bonprole.
Jorge Bermdez. Conaprole.
Jorge Olivera. Naturalia
Marcela Gonzlez. Schreiber Foods
CSIRO-Australia. Calcar
Pablo Juliano.
El grupo de trabajo agradece la colaboracin
Edward M. Fox que brindaron las empresas participantes y la
Escuela de Lechera (UTU).
 Datos productivos
Nmero de Productores Miles de Hectreas
4919 980

4305
818

2003 2012
2003 2012
Millones de litros de leche
2174

1343

DIEA (2013)

2003 2012
Importancia econmica de los quesos
Proporcin (volumen) Proporcin (U$S)

Quesos Quesos
26% 31%
LPE 43% LPE 41%
Manteca
Manteca
13%
13%
LPD 18% LPD 15%

INALE (2013)

La quesos constituyen el 26% del volumen o

el 31% de los ingresos por exportacin
La produccin lechera se ha intensificado

Chilibroste y Mattiauda (2012)

Microorganismos termodricos

Los microorganismos termodricos

sobreviven a los tratamientos trmicos
industriales y se transfieren al producto
generando diferentes problemas

Se
Causan
multiplican
defectos en
Afectan en el
el producto
salud del producto
consumidor
 No
esporulados

Microorganismos
termodricos en
la industria lctea
Esporulados Esporulados
aerbicos anaerbicos

Grupo especfico de microorganismos con capacidad de

sobrevivir a la pasteurizacin (HTST)
 Gneros bacterianos termodricos
o Lactobacillus
Produccin de gas en
o Enterococcus etapas tempranas o
o Streptococcus tardas de maduracin
o Leuconostoc
o Microbacterium
o Micrococcus
o Corynebacterium
o Bacillus
ESPORULADOS
o Clostridium

Hinchazn tarda
Defectos por produccin de gas
 Exfolias

Defectos
provocados
por la
produccin
bacteriana
de gas
BAJA MEDIA ALTA
Produccin de gas
Caccamo et al. (2004)
 Quesos
contaminados con
Clostridium
Cual es el origen de los contaminantes?

Ambiente del tambo

Modificado de Visser y Driehuis (2008)

Uso de reservas
 Relacin entre
densidad del silo y
presencia de esporas
butricas

Vissers et al. (2007)

Cmo lograr silos con bajos recuentos de
esporulados?
Alta densidad de empaque durante el ensilaje.
Sellado adecuado del silo (plstico impermeable
al oxgeno).
Alta tasa de remocin del silo.
Eliminar reas con hongos.
Uso de aditivos que control en deterioro aerbico
 Aporte de
concentrados
durante el ordee

Afrechillo

Pellets
Diferencias en consistencia de heces

Areas de contaminacin
con heces y suelo.
 Transferencia de esporas a la leche
cruda

Suciedad en ubre
3-300 mg/kg de leche.

Vissers et al. (2007)

 o Suelos pesados
o Drenaje inadecuado
o Cambios bruscos de
alimentacin.
o Perodos de lluvia

Aumento de los recuentos de

esporulados
Formas de Clostridium en una muestra de leche

Jemeljanovs et al (2009)
 Recuentos e identificacin
de esporulados anaerbicos
 Leche
pasteurizada
+
Leche Crema Leche
Lisozima
cruda pasteurizada

Muestreos en planta industrial

El bajo nmero de microorganismos por mL/g
conduce a que las tcnicas de laboratorio
aplicables son:
Nmero ms probable (NMP). Se considera
una tcnica cuantitativa, aunque los valores se
generan por metodologas estadsticas.
Determinacin
de nmero
ms probable Leche cruda
(NMP)

7 dias a 37C

Quesos
Tratamiento trmico en NMP
Condiciones trmicas Referencia
75 C por 10 min Arias et al. (2012)
75 C por 15 min Anastasiou et al. (2009)
ALP(2009)
80 C por 5 min Vissers (2008)
80 C por 10 min Bergere y Sivel (1990)
Mato-Rodrguez y Alatossava (2010)
Arias (2013)
Borreani et al. (2010)
85 C por 10 min Tma, Kuerov y Plockov (2008)
Cerny et al. (2009)
85 C por 15 min Franciosi et al. (2011)
Como afectan los tratamientos trmicos
los recuentos de esporulados
Influencia del tratamiento trmico sobre
los recuentos con C. sporogenes

Recuento de esporas viables

Condicin del (Log ufc/mL)
shock trmico
Media DE

70 C por 30 min 3.11a 0.05

80 C por 20 min
3.17a 0.05
90 C por 10 min
3.17a 0.04
Byun et al (2011)
Tubos
positivos
sembrados
Crecimiento de
aislamientos

Extraccin de ADN

Identificacin por
secuenciacin
 Produccin de gas por anaerobios
formadores de esporas
Ac. Actico + Ac. Butrico +
Lactato
CO2 + H2

La produccin de gas es visible

en los quesos con 500 a 1000
esporas/L
Tubo POSITIVO
Tubo NEGATIVO
 Usan sobres de
generacin de gas

Usan mezclas de gas

especficas de gas
(N:CO2:H2)
Microoganismos productores de gas en quesera

Bacteria Fermentacin CO2 H2

Leuconostoc Lactosa + -
LAB aromticas Citrato + - Ojos en queso
(Lld)
Lactobacillus Lactosa/(citrato) + -
heterofermentativos (NSLAB)
Coliformes Lactosa/(citrato) + - Hinch. temprana
Bacterias propinicas Lactato + - Quesos Suizos
Clostridium Lactato + + Hinch. tarda
Lactobacillus casei Lactato + O2 + -
Pediococcus spp.
NSLAB Aminocidos + - Maduracin
 Las formas vegetativas de
Clostridium presentes en la muestra
se eliminan mediante tratamiento
trmico
Artesanal Industrial

Pasteurizacin
 Resultados de recuento de
esporulados anaerbicos en la
industria lctea
Composicin en tubos positivos

63 % Clostridium

Lactobacillus spp 62.5 %

Leuconostoc spp 11.7 %
37 % Lactococcus spp 10.2 %
Otras especies 15.5 %
Especies asociadas a tubos positivos de NMP
Especie Porcentaje
Grupo Lactobacillus casei 37.5%
L. casei
L. casei/paracasei
L. rhamnosus
Leuconostoc sp. 11.7%
L. lactis
L. mesenteroides
Lactococcus sp. 10.2%
L. lactis ssp lactis
L. lactis ssp cremoris
Otros Lactobacillus 25.0%
9 especies
Queso con produccin de gas
Leuconostoc lactis
Enterococcus sp. 7.8% Leuconostoc mesenteroides
Otros microorganismos 7.8% Lactobacillus casei/paracasei
 Recuento de esporulados
anaerbicos en cinco plantas
queseras nacionales
La presencia de altos recuentos de esporulados se
asocia a los meses de invierno y verano.

Los altos recuentos durante el invierno se vinculan

con la:
1) Presencia de suciedad en ubre por la presencia
de barro.
2) Presencia de heces blandas por cambios en la
alimentacin.
3) Suplementacin con ensilaje
Recuento de esporulados anaerbicos
en diferentes pocas del ao
LECHE CRUDA
 La presencia de esporulados durante el verano
provienen principalmente de la suplementacin con
ensilaje.

Los altos recuentos en NMP pueden originarse de

cambios en el ecosistema microbiano , donde la
produccin de gas es producto de otras especies
termfilas no esporuladas.

Especies termodricas Leuconostoc mesenteroides

no esporuladas aisladas Lactobacillus casei/paracasei
 Crema proveniente del descremado
industrial en diferentes pocas del ao
CREMA
NMP de leche cruda, pasteurizada
y pasteurizada con lisozima
Promedio del perodo
 Las especie ms importante es Clostridium tyrobutyricum con
una proporcin 58.3%.
Clostridium sporogenes es la segunda especie en importancia
con una proporcin de 16.7% de los aislamientos

La presencia de especies que tienen efectos sobre la salud

del consumidor (C. botulinum, C. perfringens) pueden
comprometer la comercializacin del producto.
 Figura 1. Recuentos de esporulados anaerbicos (transformados por Log10
NMP/L) en las diferentes estaciones del ao durante los 17 meses de estudio.

LC= Leche cruda LPET= Leche pasteurizada estandarizada en tina

LPET+L= Leche pasteurizada estandarizada en tina + lisozima Cr= Crema
 Composicin de especies Composicin de especies
en leche cruda en quesos

7.2 %
17%
8% 14.2 %

7%

58%

10%
78.6 %

C. tyrobutyricum C. sporogenes C. beijerinckii

C. butyricum Clostridium spp. C. tyrobutyricum C. sporogenes
 Alta variabilidad entre establos (otoo, invierno,
verano) que pueden afectar el recuento promedio en la
leche transportada.

La primavera muestra los niveles ms bajos de

contaminacin con esporas anaerbicas.
Especies predominantes
y variabilidad gentica
 Biodiversidad de cepas de Clostridium
tyrobutyricum.

44 aislamientos

Clade 1 contiene 11
aislamientos todos
de plantas de queso
de tipo duro Italiana

Todos los quesos se

concentran en el
Clade 3 y en plantas
de queso Tipo Suizo
Grupo de mayor
similitud

Bermdez et al., J.Dairy Sci. 2016.

Dendograma basado sobre los anlisis de los perfiles de (GTG)5
Biodiversidad de cepas de Clostridium
sporogenes

46 aislamientos

Las cepas se
distribuyen en
todos los grupos

En el Clade 3
los aislamientos
provienen de una
sla planta

Bermdez et al., J.Dairy Sci. 2016.

C. botulinum en productos lcteos

Clostridium sporogenes tiene similitud gentica con C. botulinum,

requiriendo pruebas complementarias para la identificacin diferencial.

Clostridium botulinum
WPC
80

Clostridium sporogenes
 Genticamente idnticos

Clostridium Diferencias
botulinum 7 genes que
codifican para la
produccin de
toxinas

Clostridium
sporogenes
Ventajas de los sistemas pastoriles

La produccin de leche en
pastoreo tiene una menor
concentracin de esporas
anaerbicas (Clostridium)
 Sistema de produccin y
Encierro Permanente estacionalidad
(Vissers et al., 2007)
Encierro
Invierno Verano
Nocturno

Verano

2.9 2.9 2.7

800 800 506

2.1
126

41% tambos 44% tambos 30% tambos 7% tambos

> 3 Log > 3 Log > 3 Log > 3 Log
Puntos de control a nivel de tambo

Higiene de
la ubre

Rutina
Calidad del inadecuada
ensilaje de ordee
Recuentos de esporulados
en quesos
 Susceptibilidad de los quesos
Los quesos de tipo Suizo presentan
mayor susceptibilidad al
crecimiento de Clostridium:

Ambiente anaerbico
Humedad
Menor acidez de la masa
Temperatura de maduracin elevada (20-25 C)
Menor contenido de sal en la masa.
Control de esporas
Control requiere un enfoque global de los puntos de crticos

Suelo
Leche cruda
Pastura
Equipos
Ensilaje Limpieza
Aditivos
Excretas
Tecnologa

Estaciones
 Mejoras en la calidad de la leche (control a nivel primario
Leche de las principales fuentes de contaminacin)

Adicin de nitratos (Na o K): 50-150 ppm

Aditivos Adicin de lisozima : 20 ppm

Agregado de nisina o microorganismos productores

de nisina

Las bacteriocinas pueden tener efectos negativos cuando afectan

bacterias iniciadoras o aquellas que intervienen en la maduracin del
producto
Bactofugacin o microfiltracin
Tecnologa quesera que optimice el drenaje y la curva
Proceso de acidificacin
Optimizar el proceso de salado.
Realizar premadurado a bajas temperaturas (15-20
das, 7-13 C)
Limpieza de pezones reduce esporulados
en leche

Toallas secas de papel

45-50%
por 10 segundos

Toallas hmedas 50-74%

Toalla hmeda seguida

por toalla de papel seca 94%
por 20 segundos
 Puntos de control a nivel de industrial
Cultivos
Bactofugacin bioprotectores
Microfiltracin
E. faecalis

L. rhamnosus

Separacin L. casei

natural de grasa L. fermentum

C. tyrobutyricum 55.1

Manejo del S. macedonicus

proceso industrial L. rhamnosus

L. casei

Lc. lactis l

L. fermentum

C. tyrobutyricum 55.1
GRACIAS

PREGUNTAS?
Alternativas de medio de cultivo
Medios de cultivos evaluados

Medio en base a leche (UHT)

Medio Reinforced Clostridial (RCM)

Caldo tioglicolato

Medio Bryant Burkey

Modificacin de los medios anteriores

(Acidificacin, agentes reductores,
lactato de sodio, inhibidores y
colorantes)
 Esporulados distinguidos

Esporulados aerbicos
Bacillus cereus
Bacillus anthracis
Esporulados anaerbicos
Clostridium botulinum
Clostridium perfringens
Clostridium difficile