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LES TECHNIQUES

CHROMATOGRAPHIQUES
Pr. M. SAFI
Dpartement de CHIMIE
UNIVERSITE HASSAN II MOHAMMEDIA
FST MOHAMMEDIA

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PLAN
I / INTRODUCTION
II / PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE
III / CHROMATAGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PRESSION
IV / CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
V / GRANDEURS CARACTERISTIQUES EN CHROMATOGRAPHIE
VI/ ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE

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I / INTRODUCTION

La chromatographie a t invente par le


botaniste Mikhail Tswett en 1903.
Une colonne de CaCO3 permet de sparer
des pigments vgtaux . Par un mlange de
solvants, on obtient des bandes colores qui
se dplacent le long de la colonne des
vitesses propres.

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1952 : Martin et Synge ont contribu au
dveloppement de la chromatographie en
phase Gazeuse ( CPG) .
A partir des annes 70, la ralisation de
colonnes trs efficaces et le progrs
technologiques conduisent un
dveloppement spectaculaire de la
chromatographie en phase liquide haute
pression( HPLC)

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II / PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

La chromatographie est une mthode de


sparation des constituants d'un mlange mme
trs complexe.
Il existe trois principaux types de
chromatographie:
-la chromatographie en phase gazeuse (CPG)
-la chromatographie en phase liquide haute
performance (HPLC)
-la chromatographie en couche mince (CCM) et
sur Colonne.

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La chromatographie est une technique dans
laquelle les constituants d'un mlange se
sparent en fonction des vitesses auxquelles
ils sont entrans travers une phase
stationnaire par une phase mobile.

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La phase stationnaire est une phase qui reste en
place, soit dans une colonne, soit sur une surface
plane.

La phase mobile est une phase qui se dplace sur ou


travers la phase stationnaire, entranant l'analyte
avec elle.

L' lution est un processus au cours duquel les


analytes sont entrans travers une phase
stationnaire par le mouvement d'une phase mobile.

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De ce phnomne appel rtention il rsulte
que les constituants du mlange inject se
dplacent tous moins vite que la phase
mobile et que leurs vitesses de dplacement
sont diffrentes. Ils sont ainsi lus de la
colonne les uns aprs les autres et donc
spars.

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Un dtecteur plac la sortie de la colonne
coupl un enregistreur permet d'obtenir un
trac appel chromatogramme. En effet, il
dirige sur un enregistreur un signal constant
appel ligne de base en prsence du fluide
porteur seul ; au passage de chaque solut
spar il conduit dans le temps
l'enregistrement d'un pic.

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Un chromatogramme est le graphique d'une fonction
de la concentration de l'analyte en fonction du temps
(ou volume) d'lution

Dans des conditions chromatographiques donnes, le


"temps de rtention" (temps au bout duquel un
compos est lu de la colonne et dtect),
caractrise qualitativement une substance.
L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limite par
ces pics et la prolongation de la ligne de base permet
de mesurer la concentration de chaque solut dans le
mlange inject.

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III) CHROMATOGRPHIE LIQUIDE A HAUTE
PERFORMANCE ( CLHP)

La Chromatographie Liquide Haute


Performance, initialement chromatographie
liquide haute pression, est base sur les
mmes principes que la chromatographie sur
colonne et met en oeuvre, selon la nature de
la phase stationnaire, aussi bien des
phnomnes de partage que d'absorption,
d'change d'ions ou d'exclusion.

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A / SCHEMA DE PRINCIPE D'UN APPAREIL D'HPLC

Dans tout appareil de chromatographie liquide


haute performance on retrouvera toujours
les lments de base suivants :
un ou plusieurs rservoirs de phase mobile
contenant soit des solvants purs soit des
mlanges de solvants dans des concentrations
connues.
un systme d'injection comportant une boucle
d'chantillonnage calibre (gnralement une
vanne RHEODYNE).
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une colonne remplie, en acier inox, de quelques
centimtres de long.

un dtecteur permettant la fois, de mettre en


vidence la sortie des soluts de la colonne et de
donner un signal proportionnel la quantit de
chacun de ces soluts, dans un mlange.

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Les principaux dtecteurs utiliss sont les
suivants : dtecteur rfractomtrique,
dtecteur U.V. (classique ou barrette de
diodes), dtecteur lectrochimique...

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Dans tous les appareils de CLHP, on retrouve un
ensemble de modules relis entre eux par
des tubes de faible diamtre. Une ou
plusieurs pompes assurent le dbit du
solvant d'lution. En amont de l'injecteur se
trouve la ou les colonnes o s'effectuera la
sparation puis en bout de chane le
dtecteur.

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Systme classique de CLHP avec un dtecteur
barrettes de diode

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L'utilisation d'un solvant pur ou d'un mlange
de solvants de composition constante dans le
temps correspond une tude en mode
ISOCRATIQUE.

L'utilisation d'un mlange de solvants dont la


composition est variable dans le temps
correspond une tude en mode GRADIENT

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B /ETUDE DETAILLEE DES ELEMENTS D'UN
APPAREIL D'HPLC ( ou CLHP).

1 / Rservoirs

Un appareil de CLHP comprend un ou plusieurs


rservoirs, en verre ou en acier inoxydable rsistants
la corrosion et contenants les solvants.

Les poussires en suspension peuvent perturber les


sparations et gner le bon fonctionnement des
pompes et des dtecteurs. Il est donc souhaitable de
dgazer et de filtrer les solvants.
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Plusieurs techniques sont utilises : Le dgazage
peut tre effectu par une vive agitation
thermique , par ultrasons, par barbotage
d'hlium.

Des filtres permettent d'liminer les poussires,


afin d'viter que ces particules n'endommagent
la pompe, le systme d'injection ou ne bouchent
la colonne.

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2 / Pompes

La prsence d'une ou plusieurs pompes


constitue sans doute la particularit qui rend
reconnaissable toute installation de HPLC. La
pompe est ncessaire pour faire circuler la
phase mobile travers la colonne . Les
pompes dbimtriques , conues pour
maintenir un dbit stable et non puls.

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3 / Injecteurs d'chantillon

L'chantillon est inject l'aide de vanne


boucle d'chantillonnage. Les vannes
peuvent tre utilises soit manuellement,
soit commandes par un passeur
automatique d'chantillon.

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Dans la position chargement (Laod) , la vanne fait
communiquer pompe et colonne. On introduit
avec une seringue, l'chantillon dans un petit
volume tubulaire appel boucle, puis
l'chantillon gard dans la boucle pression
atmosphrique, est insr dans le flux de la
phase mobile. A cette fin on actionne un levier
qui permet par une rotation de 60 de passer
rapidement de la position de chargement la
position introduction (Inject) dans la colonne.

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1re tape de l'injection avec une
vanne six voies

remplissage de la boucle :
le solvant d'lution circule librement de
la pompe (en 1) la colonne (en 2).
L'injection est ralise (en dans la
boucle. Le surplus de solvant est vacu
dans l'effluent, communment appel
l'vier (en 4). 26
2e tape de l'injection avec une
vanne six voies

injection de l'chantillon :
on bascule la vanne par action d'un levier et le
solvant va alors balayer la boucle (de 1 4) et
entraner l'chantillon dans la colonne.

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Schma d'une vanne rhodyne

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4 / Colonnes

Elles sont le plus souvent en acier inoxydable :

-Le diamtre intrieur des colonnes


conventionnelles varie de ~ 4 10 mm

- la longueur de ~ 5 30 cm.

- La granulomtrie du support de ~2 10m.


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Il existe des microcolonnes haute
performance et grande vitesse:
- d(intrieur) ~1 4,5 mm,
- L ~ 3 7,5 cm
- d(particules) ~3 5m.

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Avantage: une colonne courte permet de
faire des sparations plus rapidement; elle
permet une conomie de la phase mobile, ce
qui est important car les solvants de haute
puret exig en CLHP sont trs chers.

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- Colonne de garde

Une prcolonne courte (0,4 1 cm) prcde


la colonne. Elle est remplie avec la mme
phase stationnaire et elle sert retenir des
impurets en provenance de l'chantillon, de
la pompe ou de la vanne d'injection. La dure
de vie de la colonne principale est ainsi
allonge.

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- Colonne thermostate
Les variations de temprature ont une
influence sur les temps de rtention. Les
appareils de chromatographie sont alors
quips avec des dispositifs de rgulation qui
contrlent la temprature 1C jusqu' 150
C.

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5 / Dtecteurs

En CLHP, les dtecteurs sont spcifiques


chaque application.

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Dtecteurs d'absorption dans UV-Vis

Cette dtection est base sur l'absorption d'une lumire


monochromatique. Elle suit la loi de Beer Lambert:

A=.l.c
= longueur d'onde dans UV Vis;
c = concentration molaire
A = absorbance du solut; sans dimension
= coefficient d'absorption molaire du solut
l = paisseur (cm) de la solution traverse ou de la
cellule.

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Il existe plusieurs types d'appareils:

longueur d'onde fixe : ex: =254 ou 313 ou 365


nm

longueur d'onde variable: 200 700 nm

barrettes de diodes, qui donnent les valeurs


des chromatogrammes en 3 dimensions
A = f(,t)

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Dtecteurs de fluorescence

Certains soluts sont fluorescents ou le


deviennent suite des ractions pr ou post
colonne. Des dtecteurs de fluorescence
laser permettent des dtections de 1 10 pg
et mme en dessous

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Dtecteurs rfractomtriques

Ils mesurent la diffrence d'indice de


rfraction entre la phase mobile et la phase
mobile avec l'chantillon. Ils ncessitent une
temprature rgule 0,01C, car les indices
de rfraction varient avec la temprature.

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- Dtecteurs d'absorption dans l'infrarouge
- Dtecteurs lectrochimiques

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C) LA PHASE STATIONNAIRE ET MOBILE

1) Phase stationnaire
a) Phase normale
La phase normale est constitue de gel de
silice. Ce matriau est trs polaire. Il faut
donc utiliser un luant apolaire. Ainsi lors de
l'injection d'une solution, les produits
polaires sont retenus dans la colonne,
contrairement aux produits apolaire qui
sortent en tte.
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Phase polaire

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Phase apolaire

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2) La phase mobile

L'interaction plus ou moins forte entre la


phase mobile et la phase stationnaire
normale ou polarit inverse se rpercute
sur les temps de rtention des soluts. La
polarit de la phase stationnaire permet de
distinguer deux situations de principe :

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si la phase stationnaire est polaire, on
utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;
si la phase stationnaire est trs peu polaire,
on choisira une phase mobile polaire ( le plus
souvent des mlanges de mthanol ou
d'actonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse.

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D) LES TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

La chromatographie d'adsorption (liquide/solide)

La chromatographie de partage (liquide/liquide)

La chromatographie d'change d'ions

La chromatographie d'exclusion

La chromatographie daffinit

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1) La chromatographie d'adsorption

Dans cette chromatographie, la phase


stationnaire consiste en une matire solide
grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde
d'aluminium, les gels de silice, Les
composants sont simplement plus ou moins
retenus la surface de la phase stationnaire.
C'est une technique qui prend en compte la
polarit des composs

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2) La chromatographie de partage

Le mcanisme de partage correspond ce que


l'on appelle souvent la chromatograhie de
partage liquide -liquide. Le partage est bas
sur la diffrence d'affinit du solut entre la
phase mobile liquide et la phase stationnaire.
Cette dernire est une phase liquide.

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Ces dernires annes, on a assist au
dveloppement des phases greffes
chimiquement : la phase stationnaire est lie
au support par l'intermdiaire de pont
siloxanes Si-O-Si.

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3) La chromatographie par change d'ions

Les changeurs d'ions sont des macromolcules


insolubles portant des groupements
ionisables, qui ont la proprit d'changer de
faon rversible certains de leurs ions, au
contact d'autres ions provenant d'une
solution

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4) La chromatographie d'exclusion

Le mcanisme correspond la sparation par


permation sur gel est un mcanisme
d'exclusion. Les molcules les plus grosses ne
peuvent pas pntrer dans les pores les plus
petits de la phase stationnaire; elles ont donc
une rtention plus faible. La sparation
rsulte ainsi de la diffrence de taille des
molcules de soluts.

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Cette technique a t surtout utilise pour des
masses molculaires leve mais, depuis peu,
on tend l'employer galement pour des
soluts de faibles masses.

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5 Chromatographie daffinit
La chromatographie d'affinit consiste greffer,
sur un support solide inerte, un ligand
prsentant une interaction ligand-molcule
conduit une fixation ou une rtention de
cette dernire.

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IV /
LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE
GAZEUSE
( CPG )
Cest une mthode de sparation de composs
susceptibles dtre vaporiss par chauffage
(sans dcomposition).
La sparation se fait dans une colonne soit par
partage soit par adsorption. Elle permet :
-la microanalyse (du g au mg)
-la sparation de mlanges complexes
-une analyse qualitative et quantitative aise
des analyses dans de nombreux domaines
dapplications.
Ses limites dapplications : elle ne convient pas
pour les produits
- qui se dcomposent chaud (thermolabiles)
- qui sont peu volatils
- ioniss.
1 - APPAREILLAGE ET CARACTRISTIQUES

1-1 - Schma dappareillage


Un appareil de CPG comprend
schmatiquement 3 modules spcifiques : un
injecteur, une colonne contenue dans une
enceinte thermostate (four) et un dtecteur
reli un intgrateur ou un ordinateur sur
lequel apparat le chromatogramme .
Schma dun appareil de CPG

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Le mlange analyser est inject sous forme
dun fluide et est vaporis dans linjecteur. Le
gaz vecteur lentrane dans la colonne de
sparation thermostate.

Les composs se rpartissent diffremment dans


les 2 phases, se dplacent donc des vitesses
diffrentes puis sortent des temps diffrents.
A leur sortie, ils sont dtects et un pic apparat
sur lenregistreur.
2 - Injecteur

Il permet : lintroduction de lchantillon, son


vaporation et son entranement par le gaz
vecteur vers la colonne. Le gaz vecteur arrive
par lune des extrmits de linjecteur et
entrane les soluts vaporiss vers la colonne.
2-1 Linjection :
se fait par le biais dune seringue de faible
volume (microseringue de 1 10 L).

Laiguille de la microseringue entre dans


linjecteur en traversant un septum (une
pastille dlastomre silicon) qui vite les
fuites de gaz au niveau de lentre. Ltat du
septum doit rgulirement tre contrl.
2-2 Temprature de linjecteur :
Linjecteur est thermostat une certaine
temprature de manire ce que le solvant
et les diffrents soluts de lchantillon
soient vaporiss.
Pour viter la condensation des produits
injects
Tinjecteur = Tproduit le moins volatil + 20C
3 - Four

Les colonnes sont places dans des enceintes


chauffes appeles four dont la temprature
peut-tre rgule au 1/10me de C prs.
La temprature du four peut-tre :
- stable et identique du dbut la fin de la
manipulation ( conditions isothermes)
- programme par palier successif (en
gradients)
4 - Colonnes

Elles contiennent la phase stationnaire. Elles se prsentent


sous forme de tubes fins enrouls.
Il existe deux types de colonnes :

4.1. Les colonnes remplies


Diamtre de 2 6 mm et longueur de 1 3 m. Elles sont
en tubes dacier .
Elles sont remplies dun support poreux et inerte sous
forme de grains sphriques ( denviron 0,2 mm de
diamtre) sur lequel est imprgne la phase stationnaire.

Exemple de supports : Chromosorb ; Sphrosil ;


Porapak
4.2. Les colonnes capillaires

Diamtre de 0,1 0,53 mm et longueur de 10


100 m.

La phase stationnaire est directement


dpose sur la paroi interne de la colonne sur
une paisseur de 0,05 5 m.
5 - Phases

5.1. Phase mobile


Elle constitue le gaz vecteur. Il sagit dun gaz
inerte et pur tel que lhlium, le diazote ou
largon. La nature du gaz ne modifie pas de
manire significative la sparation des
composants du fait de labsence dinteraction
entre le gaz et les soluts, seul le facteur
temprature est important.
5.2. Phase stationnaire

Choix de la phase stationnaire


Une phase apolaire retiendra dautant plus un compos quil sera
apolaire (et inversement)
Exemple : Squalane (apolaire) ; Carbowax (polaire)

Une phase apolaire retiendra les composs dans lordre de leur


temprature dbullition (donc sortie des composs dans lordre
de leur temprature dbullition croissante)
Une phase phnyle retiendra mieux un compos aromatique
Ex. : phases OV225 ; DC550

Une phase fluore retiendra mieux les ctones


Ex. : phase QF1
Diffrentes phases stationnaires

Les phases les plus courantes sont formes


de deux principaux types de constituants :
Les polysiloxanes
Les polythylneglycols (PEG) : polymres
polaires ( colonne Carbowax)
6 - Dtecteurs

6.1. Gnralits
Ils peuvent tre plus ou moins spcifiques des
composs dtecter.
S'il ny a pas de spcifications sur la notice de
lappareil
Tdtecteur = Tproduit le moins volatil + 20C

Il existe diffrents types de dtecteurs :


6.2. Principes des principaux
dtecteurs

- Dtecteur ionisation de flamme (FID)


Le plus utilis pour les composs organiques et de
grande sensibilit.
Les composs (gazeux) qui sortent de la colonne
pntrent dans la flamme du dtecteur. Leur
combustion entrane la formation d'ions et de
particules charges qui sont alors collects par 2
lectrodes. Le courant trs faible qui en rsulte
est fortement amplifi et transform en une
tension mesurable par un lectromtre.
Dtecteur conductibilit
thermique (Catharomtre)
Dtecteur universel
Il est form d'un catharomtre compos de 2
thermistors (= filaments chauffs) dont un est balay
par le gaz vecteur seul et l'autre par le gaz en sortie
de colonne; Quand un courant gazeux passe sur les
filaments, ils sont refroidis en fonction de la
temprature, du dbit et de la nature du gaz; la
temprature et le dbit sont les mmes pour le gaz
arrivant sur les 2 filaments mais la prsence d'1
compos en sortie de colonne modifie la nature du
gaz qui alors refroidi moins le 2me filament. Il en
rsulte une variation de rsistance proportionnelle
la concentration du compos.
- Dtecteur thermoionique (NPD)
Spcifique aux composs azots ou
phosphors.
- Dtecteur capture d'lectrons (ECD)
Spcifique des drivs halogns et trs
sensible.
V / GRANDEURS CARACTERISTIQUES EN
CHROMATOGRAPHIE

Le rsultat observable d'une analyse se


prsente sous la forme d'une courbe du
signal dtect en fonction du temps : c'est le
chromatogramme. Il comporte plusieurs pics
de forme gaussienne, de caractristiques
diffrentes.

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le temps de rtention ou tR, temps du
maximum du pic. On appelle t0 ou temps de
rtention nulle le temps correspondant un
compos non retenu .
la largeur du pic, mesure mi-hauteur :
w1/2, ou sa base, par l'intersection des
tangentes du pic ses points d'inflexion avec
la ligne de base: w.

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De l peuvent tre calcules plusieurs
caractristiques de la colonne pour la
sparation des pics :

le facteur de rtention k' du pic, par la


formule

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l' efficacit N ou nombre de plateaux
thoriques, relie la largeur du pic par la
formule

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Cette valeur mesure la finesse du pic. partir
de cette valeur peut tre calcule la hauteur
quivalente un plateau thorique (HEPT) H,
qui permet de comparer des colonnes de
longueur diffrente

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la slectivit entre deux pics 1 et 2 (2 tant
plus retenu que 1), Elle mesure la capacit de
la colonne sparer les maxima des pics.
Plus elle est suprieure 1, plus les temps de
rtention sont loigns

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la rsolution RS entre les pics 1 et 2

Cette valeur mesure la qualit de sparation et


d'absence de recouvrement entre les 2 pics
considrs.

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La rsolution ainsi dfinie est l'objectif de la
sparation chromatographique. C'est une
fonction des trois caractristiques (efficacit,
slectivit et rtention), elles-mmes dfinies
ci-dessus, dont l'expression est :

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VI/ ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE

Le but de la plupart des sparations


chromatographiques est de fournir une
analyse de l'chantillon. Celle-ci est dite
qualitative si elle permet de dterminer le
nombre et la nature des composants de
l'chantillon et quantitative si elle permet de
dterminer la quantit d'un ou plusieurs des
composants prsents.

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1) Etalonnage externe

Avec cette mthode, on analyse sparment


une solution standard et une solution
contenant le compos i ci connue
On effectue un calibrage afin de connatre le
facteur de rponse du compos i en
analysant une solution ci et mi sont
connues.

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On a mi = ci vinj = Fi Ai --------> Fi = vinj ci/Ai

On peut alors dterminer la concentration


cech des solutions analyser

cech = Fi Aech/vinj

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2) Etalonnage interne
Cette mthode est base sur la comparaison
des aires des pics correspondant aux produits
quantifier l'aide d'un compos de
rfrence (l'talon interne). Ce dernier est
introduit une concentration connue dans
l'chantillon et dans les solutions de
calibrage. On effectue tout d'abord un
calibrage afin de connatre le facteur de
rponse du constituant Fi.
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On prpare les solutions de calibrage de la
faon suivante :
Une masse mi ci connue du composer i
doser
Une masse me ce connue de l'talon
interne
On injecte un volume de la solution de
calibrage et on obtient un chromatogramme
contenant 2 pics de surface Ai et Ae.
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On a les relations suivantes :

mi = ci vinj = Fi Ai
mi/me = ci/ce = Fi/e Ai/Ae
me = ce vinj = Fe Ae

on dtermine ainsi Fi/e

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On peut alors procder l'analyse
d'chantillons prpar de la faon suivante :
mech du compos i cech inconnue
me de l'talon ce connu

On a donc cech/ce=Fi/e Aech/Ae

cech = Fi/e Aech/Ae ce

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