DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

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 1. CATALASA

• La presencia de catalasa junto con la reductasa

sirve para conocer el estado de conservación de
la leche, ya que el crecimiento o desarrollo
microbiano en la leche conlleva a la producción
de estas enzimas por los microorganismos.

• La catalasa reduce al peróxido de hidrógeno

(H₂O₂) produciendo O₂ y H₂O:

2 H₂O₂ catalasa O₂ + 2 H₂O

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 Prueba de la catalasa en la leche

• En un catalasímetro apropiado, que permite

medir el volumen de oxígeno que se desprende,
colocar 10 ml de leche y 5 ml de agua
oxigenada (3 %).

• Mantener durante 2 horas a 37 ºC y medir luego

el volumen de gas que se desprende.

• Expresar el resultado en ml de O₂.

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• Leche normal cruda hasta 30 ml de O₂

• Pasteurizada hasta 6 ml

•Cocida o esterilizada no presenta

desprendimiento.

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 2. PEROXIDASA
La peroxidasa es una enzima que cataliza la
oxidación de ciertos compuestos dadores de
hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y
aminas aromáticas (o-fenilendiamina) sólo en
presencia de peróxido de hidrógeno (H₂O₂).

El sustrato oxidable más usado es el guayacol, el

cual es oxidado a un complejo coloreado de
tetraguayacol en presencia de peroxidasa: La
velocidad de formación del color rojo ladrillo puede
ser utilizada como medida de la actividad
enzimática por lectura espectrofotométricas de las
absorbancias en función al tiempo.

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 PEROXIDASA

Esta prueba se usa para evaluar la eficiencia

del escaldado de verduras y también en el
control de la pasteurización de la leche.

A la temperatura de pasteurización de la leche

la lactoperoxidasa se inactiva, pero se
regenera con el tiempo; en cambio, si la
leche es sobrecalentada (más de 80-85 ºC), la
peroxidasa pierde su actividad en forma
definitiva

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PRUEBA DE LA PEROXIDASA EN VEGETALES DESHIDRATADOS

1. Tomar una pequeña cantidad de muestra y reconstituir en agua fria

por 10 a 15 min.

2. Eliminar exceso de agua y colocar pequeños trozos de la muestra en

tubo de ensayo de 1 pulg. de diámetro hasta más o menos 1 pulg. de
altura.

3. Agregar 10 ml de agua, 1 ml de solución de guayacol (2-metoxifenol al

1% en alcohol de 95% y 1ml de solución fresca de peróxido de
hidrógeno al 0.5%

4. Agitar el tubo para mezclar y observar la reacción al cabo de 5-10 min.

La reacción será:

Negativa: Si no hay decoloración, o aparecen pequeñas manchas

rojas, o manchas alrededor de las venas.
Ligeramente positiva: Si aparecen manchas marrones esparcidas por
todo el tejido, o enmarronamiento pronunciado de algunos
trozos del producto.
Positiva: Si se produce una coloración marrón rojiza más
pronunciada que el caso anterior
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 3. FOSFATASA

La fosfatasa es una enzima que se

encuentra en forma natural en la leche.
Cuando la leche es pasteurizada, esta
enzima es destruida, por lo tanto, la
presencia de ella en una leche
supuestamente pasteurizada indicaría
un mal o insuficiente proceso térmico.

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 Prueba de la fosfatasa

a) Fosfatasa + Fenil fosfato disódico -------->

Fenol + otros productos

b) Fenol + 2,6 Dicloroquinonacloramina ------->

Compuesto coloreado (azul) + Cl- + otros productos

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10
 Determinación de fosfatasa en la leche

• Mezclar la muestra de leche con fenilfosfato

disódico y buffer carbonato.

• Colocar la mezcla en una bolsa de diálisis y calentar

hasta 37 ºC durante una hora: La fosfatasa presente
reaccionará con el fenilfosfato para liberar fenol, el
cual será dializado a través de la bolsa.

• Luego el fenol se hace reaccionar con CuSO4 y 2,6

dicloroquinonacloramina para producir un
compuesto coloreado, el cual se lee en un
espectrofotómetro a 650 nm.

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 4. POLIFENOLOXIDASA

Estas enzimas son las principales causantes

del pardeamiento enzimático.

Las polifenoloxidasas catalizan la oxidación

de compuestos fenólicos a quinonas, las
cuales continuan oxidándose por la
presencia del oxígeno del aire sobre el tejido
recién cortado, formándose pigmentos
oscuros, melanoides, por polimerización.

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Determinación de polifenoloxidasa (en peras y
manzanas)

El método se basa en medir espectrofotométricamente,

a intervalos de 1 minuto, el aumento en la
absorbancia de una mezcla de la solución
enzimática con ácido clorogénico como sustrato.

Al graficar la absorbancia contra el tiempo, los

resultados se expresan en aumento de absorbancia
por minuto por gramo de proteína.

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 Determinación de polifenoloxidasa

Procedimiento

• En un matraz de 125 ml colocar 25 ml de solución tampón pH 5.2 y 10

ml de solución de ácido clorogénico. Mezclar suavemente y mantener
por 10 minutos a 30 ºC.

• Agregar 5 ml de solución enzimática ajustada a 0.1 mg/ml de proteína,

agitar suavemente por unos segundos y volver a llevar a baño de agua
a 30 ºC (sin agitación posterior).

• A intervalos de 1 minuto o 30 segundos leer el aumento de la

absorbancia a 390 nm.

• Como blanco se usa una mezcla igual a la anterior, pero hervida por
10 minutos , reconstituyendo su volumen original con agua.

Cálculos

Para expresar la actividad enzimática se grafican la absorbancia por

minuto y por gramo de proteína contra el tiempo (cada minuto) y se
usa la pendiente inicial de la curva obtenida (porción recta).
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 5. PECTINO-ESTERASA (P.E.) O
PECTINO-METIL-ESTERASA

Esta enzima produce la hidrólisis de la pectina,

formando ácido péctico o poligalacturónico y
metanol, al actuar de preferencia sobre los
enlaces metílicos, vecinos de grupos
carboxílicos libres.

Estas enzimas, al degradar la pectina, son las

causantes de la pérdida de las
características de turbidez de algunos jugos
y néctares, por lo que éstos deben ser
calentados para inactivar dichas enzimas.
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 Determinación de la actividad de la pectino-esterasa (P.E.)

La pectino-esterasa hidroliza los grupos metoxilos de la molécula de pectina; es

posible medir la liberación de los grupos carboxilos por titulación
potenciométrica con álcali.

Procedimiento:
• Se pesan 175 g del material (cebolla, naranja, pulpa y cácara) y se le agrega 5 g
de cloruro de sodio (para activar la enzima y ayudar a su extracción) y se
homogeniza.

• Si se trata de cebolla se toma 1 parte del homogeneizado y 1 parte de agua; en

el caso de la naranja se toma 1 parte del extracto crudo y 2 partes de agua. Se
agita por 4 min., dejando en reposo por un momento y luego se toman
alícuotas para efectuar la reacción como sigue:

• Se toman 50 ml de la solución de pectina al 1 % y se le agrega 10 ml de la

solución del extracto.

• Se coloca en baño de agua a 30 ºC. Se ajusta el pH a 7.5 con Na OH 0.01 N.

• Cada 5 min., durante 30 min., se ajusta el pH anotando en cada intervalo la

cantidad acumulativa de álcali gastado. Las curvas se obtienen graficando los
ml gastados de álcali versus tiempo.

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 Determinación de la actividad de la pectino-esterasa (P.E.)

Se prepara un blanco con la solución enzimática calentada a baño de

agua hirviente por 5 min., no debe presentar gasto de hidróxido de
sodio, de lo contrario, su valor debe ser restado del consumo total.

Cálculos:
G x 3.1
Unidades de pectino-esterasa/ml de solución enzimática = ----------
E

Donde, G = Gasto total de ml de NaOH 0.1n

E = Mililitros aplicados de la solución de enzima
3.1 = Factor de Kertesz

• Las unidades de pectino-esterasa por ml de solución enzimática

también representa los mg de grupos metoxilo separados por 1 ml de
solución de enzima en 30 minutos.

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 6. UREASA

La ureasa es una enzima que se

encuentra en algunos productos
vegetales, como por ejemplo en la
soya, la cual contiene una ureasa
termolábil, cuyo grado de inactivación
es un indicador de la destrucción de
inhibidores de proteasas durante el
tratamiento térmico de las tortas de
soya.
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 UREASA
La ureasa cataliza la siguiente reacción (Pomeraz y Meloan, 1982):

NH₂
O =C + H₂O CO₂ + 2 NH₃
NH₂

Ambos productos de esta reacción pueden ser medidos y, por lo tanto,

usados para la determinación del contenido de úrea de una muestra.

El CO₂ puede ser medido gasométricamente o colorimétricamente.

El amoníaco puede ser determinado directamente después de la

destilación sobre un recipiente adecuado, o por titulación después de
una difusión. El amoníaco también puede ser determinado
colorimétricamente con el reactivo de Nesslers después de su
separación por destilación o por cromatografía de intercambio iónico.

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 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA EN LA SOYA

La reacción que cataliza esta enzima sobre la úrea, la liberación de amoníaco, es el

principio sobre el cual se basa la siguiente prueba para determinar la presencia de
ureasa:
Reactivos:
• Substrato: Solución de urea 0.17 M en agua bidestilada, a 30 °C (pH 6.1)
• HCl 0.1 N
Procedimiento:
1. El material a ensayar se muele, y se extrae la enzima con agua destilada a
temperatura de 30 ºC. Se filtra o centrifuga, usándose el sobrenadante para la
determinación de la actividad enzimática.
2. Colocar 50 ml del substrato (sol. Urea) en un matraz Erlenmeyer y agregar una
alícuota del extracto enzimático en estudio.
3. Dejar la mezcla a 30 ºC durante 10 minutos.
4. Valorar el amoníaco liberado con HCl 0.1 N, ajustando el pH a 6.1 con ayuda de un
potenciómetro.

Unidad enzimática (U)

1 U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo

disocia 1 micromol de úrea por minuto.
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 7. ACTIVIDAD DIASTÁSICA

La Actividad Diastásica es la capacidad que tienen las enzimas

diastásicas para convertir el almidón en azúcar. Las principales
enzimas diastásicas en una harina son las  y  amilasas.

A la Actividad Diastásica también se le conoce como Indice de

Diastasa o Poder Diastásico.

En el caso de la miel, la Actividad Diastásica se define como la

cantidad, en centímetros cúbicos, de una solución de almidón
al 1 % hidrolizada en una hora por la enzima contenida en 1 g
de miel.

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 8. REDUCTASA

La reductasa es una enzima que puede estar presente en la

leche y que puede tener su origen como producto de la
acción microbiana, y bajo la forma natural como aldehído-
reductasa (componente de la leche). Por lo tanto, la
determinación de la reductasa sirve para inferir sobre el
estado higiénico de la leche, así como para controlar el
tratamiento térmico (pasteurización) al que ha sido
sometida la leche.

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 Prueba de la reductasa

• En un tubo de ensayo, grande y estéril, verter ascépticamente

20 ml de leche (dentro de las 4 horas siguientes a la extracción
de la muestra) y 1 ml de solución de azul de metileno (mezcla
de 5 ml de solución alcohólica saturada de azul de metileno +
195 ml de agua).

• Tapar el tubo y calentar a 37 ºC por 5 minutos.

• Invertir el tubo varias veces para asegurar la distribución

uniforme de la crema e incubar a 37 - 38 ºC en posición vertical,
invirtiendo cada media hora y protegido de la luz solar o
eléctrica.

• Medir el tiempo desde que se inicia la incubación hasta que por

lo menos los 4/5 de la leche se han decolorado.

• La leche cruda y la pasteurizada deben resistir más de 5.5

horas sin decolorarse, y la destinada a la pasteurización, por lo
menos 3 horas.
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