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Biotechnologie végétale

Elaboré par : Mohamed Mounir SAGGAÏ


Chapitre I: Quelques procédés
biotechnologiques des cultures in vitro

• Bases cellulaires et physiologiques de l’organogenèse in vitro

• Différenciation et dédifférenciation cellulaire

• Aspects moléculaires de la variation somaclonale


Bases cellulaires et
physiologiques de
l’organogenèse in vitro
Chapitre II: Place de la culture in vitro dans
les schémas de production des plantes

• Micro propagation; calogenèse, rhizogenèse

• Embryogenèse somatique et semences artificielles


2- La MICROPROPAGATION
La multiplication végétative par culture in-vitro ou micropropagation présente plusieurs
avantages sur les méthodes classiques dites " conventionnelles "de propagation . Cette
technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez lesquelles les semences sont rares,
ou présentant des difficultés de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de
greffage sont inapplicables , ce qui a conduit à une plus grande diversité des plantes
commercialisées.
De même plusieurs autres techniques, toutes dérivées de la culture in-vitro ,ont un rôle
important à jouer dans l'amélioration des performances agronomiques ou horticoles des plantes
cultivées. La micropropagation est utilisé dans un but de multiplication en masse , puisqu'elle
permet , en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre considérable de plantes
génétiquement identiques à la plante mère ( FERRY et al.,1998; SEMAL,1998). Les plants
reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une grande uniformité.
Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite peu d'espace et peu être programmé
indépendamment des saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant
aux perspectives industrielles et économiques importantes (MARGARA,1982; BOXUS,1995;
SEMAL,1998; SKIRVIN et al., 2000) .
Les techniques de micropropagation empruntent essentiellement deux voies ,
 L'une qui utilise des tissus méristématiques (méristème ou apex de tige,
bourgeons axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au
développement normal, d'un individu est appelée microbouturage
(SAADI,1991) cette technique est souvent appelée "multiplication conforme"
car elle part de méristème préexistant dans les quels , les cellules sont
génétiquement très stables (AMATO,1977 in BOXUS,1995),l'individu est
généralement obtenu en deux étapes successives, d'abord la production de
tige ,puis son enracinement .
 L'autre voie, utilise toute sorte tissus différenciés (fragments de tige, de
racines, de pétiole , de feuilles, d'embryons matures et immatures
,d'hypocotyles, cotylédons...etc) pour aboutir à la néoformation soit de
bourgeons ou de racines , c'est l'organogenèse ,soit de structures ressemblant
aux embryons zygotiques, c'est l'embryogenèse somatique (ZRYD,1988 ;
MARGARA,1989).
1- Cultures de méristèms

les premiers résultats de cultures de méristèmes appelées communément "cultures d'apex" furent obtenus par
KOTTE et ROBBINS, dés 1922 à partir de méristème radiculaires de fève et de maïs( TOUTE,1998).

Dix ans plus tard, WHITE(1934) obtiendra une culture indéfinie de racines de tomate . En même temps, il
s'apercevait que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans des racines de tomate isolées , le
virus n'atteignait pas les cellules méristématiques . Plus tard , LIMASSET et CORNUET(1949) montrent que les
organes jeunes de tabac ne renferment que très peu de virus (TMV) et que les méristèmes apicaux n'en
contiennent pas .
1- Cultures de méristèmes

En 1952, partant de ces observations, MOREL et MARTIN tentent de prélever des pointes méristèmatiques de dahlias viroses
pour reproduire des dahlia génétiquement semblables aux parents, mais exempts de virus . Ils réussiront de la sorte à
éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted wilt virus". En 1955 , ils régénéreront de façons analogue des pommes de terre
atteintes de virus A et Y (BOXUS, 1995).

Depuis lors , la culture de méristèmes à conduit à des applications nouvelles , originales concernant le domaine du
phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses maladies (viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a
permis la régénération d'un grand nombre d'espèce saines (TOUTE, 1998).

Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue ,confèrent à la plante une organogenèse
permanente chez les végétaux supérieurs. Ils représentent des petits massifs de cellules indifférenciées (0.1mm) et
conservent la capacité de se diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent jusqu'à leur mort le caractère juvénile.
Elles jouent un rôle capital dans le développement végétal puisqu'elle édifient tous les organes (CAMEFORT, 1977;
MARGARA, 1989).
1- Cultures de méristèms

En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon axillaire, le plus souvent indemne de
maladies. On pourra très rapidement obtenir de nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et
débarrassées de maladies dont elles étaient affectées (SCHMID et KELLER, 1984; SAMA et al., 1998;). Il est même possible
de reconstituer des clones indemnes de maladies à partir de pieds -mères malades. D'après TOUTE, 1998; FLETCHER et al.
,1998 , il existe plus de 50 espèces végétales qui ont été ainsi assainies c'est le cas de la pomme de terre , la canne à sucre ,
de dahlia ..etc .

La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre pour éviter l'apparition de plantes non conformes
à la plante mère ou variants (SAADI, 1991) . Elle paraît plus intéressante chez les plantes allogames ou il est généralement
impossible de conserver des génotypes intacts par reproduction sexuée classique.
2- Organogenèse

l'organogenèse est la base fondamentale de la multiplication végétative , laquelle s'appuie toujours sur la formation de
méristèmes nouveaux (MARGARA,1989). En partant d'un explant , elle aboutit à la formation d'un nouvel individu par
l'élaboration de bourgeons (caulogenèse ) et de racine (rhizogenèse).
2- Organogenèse
2.1-Caulogenèse
2.1.1 Définition
La caulogenèse désigne à la fois l'initiation et le développement des bourgeons terminaux, axillaires, adventifs ou néoformés
sur un cal.
 Les bourgeons terminaux dérivent de la gemmule de l'embryon.
 Les bourgeons axillaires sont produits généralement par les deux ou trois assises cellulaires superficielles de la tige.
 Les bourgeons adventifs sont formés en des endroits inhabituels. Ils sont formés à partir d'organes différenciés de la
plante (entre nœuds, tubercules, racines). Ils peuvent avoir pour origine des massifs cellulaires restés méristèmatiques ou
bien provenir d'une différenciation de certaines cellules(CAMEFORT, 1977).
 Les bourgeons néoformés in-vitro peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal, ils peuvent être considérés comme
un cas particulier de bourgeons adventifs BOXUS, 1995). Ils sont induits sur n'importe quel type d'organe ou de tissu y
compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions naturelles (CAMEFORT, 1977; ZRYD, 1988; MARGARA,
1989).
2.1.2 -Origine des bourgeons

Les études cytologiques, conduites dans le but de déterminer l'origine des bourgeons
néoformés à partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent
que l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de certaines catégories de tissus
telle que: le cambium ,le parenchyme vasculaire ou libérien (BELANGER, 1998;
FORTES et PAIS, 2000).

L'intensité de cette néoformation est nettement dépendante de la nature des tissus


contenus dans l'explant. Elle est maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les
tissus du phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le parenchyme cortical ou
médulaire (MARGARA, 1989) .
2.2 Rhizogenèse
2.2.1 Définition
La Rhizogenèse désigne la néoformation et la croissance de racine. Les
méristèmes de racines se répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines.

 Les racines latérales se forment de manière spontanée sur la racine principale


dans les conditions naturelles.

 Les racines adventives sont produites par des organes divers, soit spontanément,
soit accidentellement à la suite d'une blessure ou d'une manière provoquée,
dans les conditions du bouturage et du marcottage.

 Les racines néoformées, au sein d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être
considérées comme un cas particulier de méristèmes adventifs (rhizogenèse
indirecte) ou l'émission de racines sur un explant dans des endroits
inhabituelles (rhizogenèse directe).
2.2.2- Origine des racines néoformées
La rhizogenèse est un phénomène complexe, il comporte différentes phases :
la dédifférenciation, formation d'amas de cellules méristèmatiques , différenciation et
organisation des amas méristèmatiques en primordium racinaire qui se développeront
en jeunes racines ( MARGARA , 1989; BOXUS, 1995).

L'origine des cellules impliquées dans la cicatrisation dépend de l'espèce. FAVRE


(1985) inBOXUS,(1995)sur son modèle vigne relève que ce sont les cellules du phloème
primaire qui réagissent les premières. Les cellules non lignifiées d'origine secondaire et
le parenchyme cortical, ou même la moelle peuvent également réagir en formant un
tissu cicatriciel plus ou moins important. Mais dans tous les cas, c'est l'assise
génératrice libéro- ligneuse ( combium) qui donne, des tissus de bonne aptitude
callogène. Le cal est formé essentiellement de cellules de type méristèmatique
secondaire, qui incorporent certaines cellules voisines parenchymateuses . Les cellules
méristèmatiques se différencient par la suite et s'organisent pour donner naissance à
une nouvelle racine.
3-Embryogénèse somatique
3.1-Définition

Classiquement, l'embryon est défini comme étant une plante se trouvant au stade
initial de son développement. Il s'agit en fait d'une structure bipolaire ( munie de
deux méristèmes : l'un caulinaire et l'autre racinaire) qui, suite au processus de
germination, donne naissance à une nouvelle plante.

Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé


lors de la reproduction sexuée (embryon zygotique) .
Cependant, d'autres types d' embryons peuvent également se développer à
partir de cellules du sporophyte ou du gamétophyte, embryons qui ne sont pas le
produit d'une fusion gamétique et qui sont appelés "embryons somatiques" . Parfois,
chez certains espèces, ils résultent d'une embryogenèse somatique naturelle qualifiée
d'apomixie . Dans certains cas en effet, les anthérozoîdes , l'oosphère , voire d'autres
cellules gamétophytiques peuvent engendrer des embryons parthénogénétiques.
Dans d'autres cas, certaines cellules sporophytiques localisées au niveau des tissus
intra-ovulaire, en particulier le nucelle, fournissent naturellement des embryons
apoméiotiques appelés aussi "embryons nucellaires. Ce type d'embryogenèse est très
développé dans la famille des Rutacées, spécialement chez les Citrus (TISSERAT et
al., 1979;VARDI et al., 1990) Toutefois, cette appellation est essentiellement appliquée
, selon certains auteurs comme PIATTI, (1988) et MARGARA, (1989), aux embryons
obtenus à partir de culture de tissus in-vitro du sporophyte .
3.2 - Origine et développement des embryons somatiques

Les donnés cytologiques montrent que les embryons somatiques ont pour origine
des cellules particulières; dites embryogènes. Elles présentent des caractères de
cellules méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense, gros noyaux
aux nucléoles proéminents et petites vacuoles.

Elles fixent de manière intense les colorants ce qui les rend aisément repérables en
cytologie(JULLIEN, 1991 ;LOISEAU et al .,1998; VASLENKO et al, 2000).

Selon SHARP et al (1980)in PIATTI (1988)décrivent deux voies pour


l'embryogenèse somatique:
La première dite est l'embryogenèse directe où les embryons sont initiés à partir
de tissus en absence de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules
pré-embryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou les cellules sont déjà engagées
dans un développement embryogène et ils ont besoins seulement d'être libérées
(PIATTI,1988; ROUGET,1989). Elle semblent préexister dans les tissus de
certains explants comme les embryons immatures ou les fragments de très
jeunes plantes (SAADI, 1991) .
La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte, pour la quelle
une prolifération cellulaire est requise. Les travaux de SHARP (1980) et d'EVANS
(1981) in PIATTI(1988) ont également pu servire à mettre en évidence, l'existence de
cellules initiatrices qui sont déjà différenciées mais dépourvues de capacité
embryogènes. Ils les nomment des cellules pré-embryogènes
indéterminées(PEIC).Les cellules embryogènes apparaissent tardivement au sein
du cal produit par la réactivation mitotique des cellules différenciées et/ ou la
prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de type racines, tige ou de
feuille(JULLIEN,1991 ; RUGKHLA et JONES , 1998)). Leurs multiplications aboutit à
la formation de groupes de cellules embryogènes "nodules méristèmatiques"
dispersés, parmi les autres cellules du cal et qui sont généralement de type
parenchymateux. A la suite de leur repiquage sur des milieux dépourvus d'auxines,
ces nodules évoluent en des embryons somatiques comme c'est le cas chez la
carotte (SAADI,1991).
Les embryons somatiques connaissent les même stades de développement
morphlogiques que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir :
stade globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire(EGERTSDOTTER et
ARNOLD , 1998). Ils ont une structure chromosomique souvent semblable à
celle de la plante- mère dont ils sont issus (NUTI RANCHI, 1995) . Le critère qui
permet de reconnaître un embryon somatique est certainement sa structure
bipolaire, qui développe précocement et simultanément un méristème caulinaire
et un méristème racinaire (NORREL, 1973 ; NUTI RANCHI , 1990).
3.3 Intérêt de l'embryogenèse somatique

Historiquement , les premiers embryons somatiques ont été signalés, en 1958,


par l'équipe de REINERT & STUART sur des cultures du parenchyme libérien de racine
de carotte (BELANGER, 1998).Depuis et grâce au progrès spectaculaire que connaît les
techniques de cultures in-vitro, la production d'embryons somatiques est devenue
possible chez un grand nombre d'espèces végétales.

Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in-vitro ,


l'embryogenèse somatique se montre plus séduisante en terme de performance et
d'efficacité (HARKMAN et ARNOLD , 1985 ; PIATTI, 1988). En effet, la maîtrise de la
production d'embryons, chez certaines espèces, via les suspensions cellulaires permet
d'obtenir des milliers d'embryons par litre de milieu de culture et par conséquent la
régénération de milliers de plants. L'embryogenèse somatique permet aussi en un
temps très court de produire des plantes entières sans passer par les contraintes que
connaît habituellement l'organogenèse ( phase de caulogenèse et de rhizogenèse)
(DAIKH et DEMARLY, 1987 ; ROGUET, 1989).
La voie de l'embryogenèse somatique est actuellement intégrée dans de nombreux
schémas de sélection puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des
cycles d'amélioration comme par exemple , le temps nécessaire à la valorisation du
matériel sélectionné âgé ou juvénile ou la production de parents hybrides
nécessaires à la diffusion de nouvelles variétés (DEMARLY et SIBI, 1989 ; DEMARLY,
1994; STANANTINO et al., 1998; LOISEAU et al., 1998; TREMBLAY et al., 1999). De
telles applications ont été réalisées chez plusieurs espèces comme le café
(CARNEIRO, 1999) ; la carotte (TOUTE,1998); la luzerne (REDENBOUGH et al.,
1986 FUJII et al., 1987 ; STUART et al., 1987 ; RAY et BINGHAM, 1989) ;Asparagus
officinalis (MAMIYA et SAKAMOTO , 2001); le palmier dattier (FERRY et al, 1998) et
le palmier à huile (RIVAL et al., 1998).
4. Facteurs de la régénérabilité

Les facteurs influant sur la régénérabilité in-vitro peuvent être schématiquement


répartis en 2 groupes ( figure 2) . Le premier représente Les facteurs internes , ( ceux
liés à la plante) et concerne d'une part le génotype , la nature et l'âge ontogénique de
l'explant et d'autre part l'état physiologique de la plante mère sur laquelle, l'explant
a été prélevé . Le second réunit les différents facteurs externes qui englobent et les
milieux (notamment leur composition en régulateurs de croissance et les sucres ) et
les conditions de cultures.
4.1- Effet de l'explant

Un des atouts majeurs de la culture in-vitro est de montrer que des cellules somatiques
(à 2n chromosomes) , pouvaient produire , soit des structures comparables à des
embryons somatiques, soit à des bourgeons et dont le développement permet de
régénérer des plantes conformes à la plante mère . Pratiquement, n'importent quel
organe(bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant), prélevé
sur celle-ci , peut être cultivé isolément sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de
celui-ci est d'une importance primordiale . On retiendra cependant que la réponse in-
vitro est sous la dépendance de nombreux facteurs .
· L'âge physiologique et ontogénique de l'organe

Généralement dans les cultures in-vitro ,on privilégiera les explants les plus jeunes
(embryons immatures , jeunes feuilles , méristèmes etc.) car c'est l'état juvénile
qui semble offrir le plus de possibilités de régénération ( DAVIS, 1986.,SAADI,
1991). Souvent , ce sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus
souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la régénération, .C'est
le cas par exemple du pois (SAADI, 1991); du lupin (DESIRE, 1988) , du coton
(BRAR et al. , 1998) ; du soja (SANTAREM et al ., 1997); du tournesol(CHARNIERE
et al., 1999) ; Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) et bien d'autres espèces.
· L'époque du prélèvement

Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade
de vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à
développer des réactions différentes en culture in-vitro. Cette différence peut être
expliquée par la modification des équilibres internes des régulateurs de
croissance (auxines, cytokinines, gibbérelline ...) lors des différentes saisons
(AUGE et al., 1989) .
· La taille de l'explant

Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants et les
conditions extérieures seront influentes . La taille choisie variera selon la nature de
l'explant . si le tissu végétal est de nature organisée , un ensemble assez complet sera
nécessaire ( soit un noeud , un apex , ou un bourgeon entier ) mais dans le cas d'une
structure différenciée ( éléments de feuilles , de tige, de racines ,inflorescence..) des
fragments de 5à 10 mm suffiront ( ZRYD, 1988., AUGE et al ., 1989; HANNWEG et al .,
1996).
D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles » qui
répondent à un stimulus indicateur qui orientera son programme morphogénétique vers
une voie particulière de développement contrairement à certains tissus récalcitrants aux
manipulations in-vitro, dues essentiellement à un manque de compétence
cellulaire(COLEMAN et ERNST, 1990 ; NUTI RONCHI, 1995 ; YADAV et RAJAM , 1998).
4.2-Influence du génotype

La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée à


l'espèce. A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis
qu'un autre ne peut fournir que des embryons(AUGE et al ., 1989) . Cependant,
plusieurs auteurs mentionnent que seulement certains génotypes paraissent posséder
la capacité d'induire une embryogenèse somatique . Cette capacité, chez beaucoup
d'espèce semble être génotypiquement contrôlé ( GEORGE et SHERRINGTON , 1984 .,
BROWN, 1988 ; DODEMAN et al ., 1997 ) .
Un tel contrôle de la régénération ( par la voie de l'embryogenèse somatique ou de la
caulogenèse ) a été rapporté chez les Légumineuses fourragères est spécialement chez
la luzerne par BROWN et ATANASSOV (1985); Trifolium repens par PARROT (1991) et
bien d'autres espèces . BENCHEIKH et GALLAIS (1996 ) indiquent la présence de
quelques gènes majors pouvant contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De
même BINGHAM et al (1975) ont réussit à augmenter considérablement la fréquence
embryogène chez Médicago sativa après deux étapes de sélection récurrente. REISCH
et BINGHAM , (1980) trouvent chez un génotype de luzerne diploïde que la
différenciation de bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux gènes dominants
désignés Rn1 et Rn2 dont la présence simultanée permet un taux élevé de régénération
( plus de 75 % des explants) . L'hétérogénéité existante chez les Légumineuses
fourragères, permet d'expliquer la facilité à identifier les génotypes favorables à la
régénération .
4.3-Influence du milieu de culture

Avec le développement des cultures de tissus, divers milieux de


base comprenant des sels inorganiques, des composés organiques (sucres,
vitamines et régulateurs de croissances) ont été progressivement utilisés
.Certains milieux proposés dans un but donné sont en fait utilisables d'une
manière beaucoup plus étendue.

Les milieux de culture sélectionnés doivent être le plus parfaitement


adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude afin de laisser
s'exprimer pleinement son potentiel génétique.
Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement représentés
par les macro et les micro-éléments, une source carbonée et azotée, des vitamines et
des régulateurs de croissance.

Selon EVANS et al , (1981) ,dans 70% des cas , des milieux de culture de base de type
MURASHIGE et SKOOG (MS) ont été utilisés. Il a été employer d'une manière
générale pour tous les types de cultures in-vitro . Mais c'est essentiellement pour le
déclenchement de l'organogenèse , en particulier pour la néoformation de bourgeons
que s'est révélé nettement supérieur à d'autres milieux (MARGARA, 1989) c'est le cas
du Cunila galioides ( FRACARO et ECHEVERRIGARAY , 2001).
Le milieu de MURASHIGE et SKOOG est caractérisé principalement par une
très forte teneur en sels minéraux , en particulier en potassium et par une
concentration également élevée en azote (60méq/l environ sous forme de
nitrate et d'ammonium ) dont 1/3 apporté sous forme réduite (ionsNH4+); le
rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à l'induction de
l'embryogenèse somatique , en particulier chez Feijoa sellowiana (DEL
VESCO et GUERRA , 2001).
Il apparaît à travers la recherche bibliographique que nous avons
effectuées , qu'il existe deux composantes majeurs du milieu qui peuvent
intervenir dans l'orientation du phénomène de morphogenèse et qui sont
représentées par les régulateurs de croissances et la source carbonée.
4.3.1-Les régulateurs de croissance

Un régulateur de croissance est défini comme étant, une substance qui, suivant sa
concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, permettre ou
modifier sous certaines conditions les processus de cytodifférenciations (STREET,
1977).

Aucun régulateur de croissance ne provoque une initiation directe du phénomène


d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique , mais il interfère dans de nombreux
métabolismes internes de la cellule végétale.
l'organogenèse est fortement influencée par les régulateurs de croissance. Les
deux hormones, les plus souvent utilisés, d'une manière conjointe ou
séquentielle, sont les auxines et les cytokinines. NITSH et NOUGAREDE ,(1967)
ont montré que des explants de parenchyme médullaire de tabac cultivés in-vitro
dans un milieu ne contenant ni auxine ,ni cytokinine ne prolifèrent pas. Il en
était de même lorsque seulement une auxine ou une cytokinine était incorporée
au milieu. Par contre , la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux
substances sont présentes dans le même milieu de culture.
Le rapport hormonal (auxine/ cytokinine) conditionne, en grande partie, le type
de néoformation obtenu. Ce rapport a conduit, dans le cas de la culture in-vitro
du parenchyme médullaire de tabac, par exemple , à l'orientation des tissus, soit
vers la caulogenèse , soit vers la rhizogenèse (SKOOG et MILLER, 1957 in ZRYD
,1988). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent favorisée par des teneurs
élevées en cytokinine (FRETT, 1977; WALKER et al., 1979; MARGARA , 1989;
ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et al., 2001; TANG et GUO, 2001 ) alors que
les fortes doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs
qualités (DRUART, 1992, HOBBIE, 1998; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et
al., 2001).
L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant , pas une règle générale pour
toutes les espèces végétales . En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au milieu
de culture l'un ou l'autre des deux régulateurs précités pour parvenir à une réponse
morphogénétique (SEON et al. , 1998). Dans ce cas précis, nous pouvons citer deux
exemples : le premier, concerne le Tritical où l'organogenèse a été obtenue en se
servant uniquement d'auxine ( milieu dépourvu de cytokinine) (VIKRANT et
RASHID , 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi gamble où l'équipe
d'ANAND et RAO,(2000) a obtenu des bourgeons néoformés en utilisant des
cytokinines seules dans le milieu d'induction

Par ailleurs ,il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses
obtenues dans ce domaine , qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité
des différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les
effets paraissent varier essentiellement avec le matériel végétal employé.
Tout comme l'organogenèse, Les régulateurs de croissance de type auxine et
cytokinine sont aussi indispensables à l'embryogenèse somatique.

La production d'embryons somatique est généralement obtenue en deux phases de


culture, sur des milieux qui différent essentiellement par leurs concentrations en
régulateurs de croissance (AUGE et al., 1989). Par exemple, chez la carotte ou la
luzerne, les embryons sont obtenus en deux phases: Une phase dite d'induction
réalisé sur un milieu souvent riche en régulateurs de croissance en particulier en
auxines permet la formation et / ou la prolifération des cellules embryogènes. Ces
cellules n'évolueront en embryons qu'au cours d'une deuxième phase dite de
développement qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus induits, sur un
nouveau milieu moins riche , voir dépourvu de régulateurs de croissance
essentiellement en auxines (SAADI, 1991 ; GIORGETTI et al.,1995) .
Cette façon de faire ou plutôt ce schéma de transfert a été appliqué avec succès
dans de nombreux travaux de recherche portant sur l'obtention de l'embryogenèse
somatique . Nous citons, à titre d'exemple, les travaux réalisés à partir d'embryons
immatures de graminées (JULLIEN, 1991) , de pois (SAADI, 1991), de coconut
(NAIR et al ., 1999) , de Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) , d'Arabidopsis
thaliana ( GAJ, 2001 ) ; de boutons floraux du bananier (ESCALANT et al., 1994) ;
d'hypocotyles du tournesol (LAPARRA et al., 1997) ; des feuilles du Santalum
album et Santalum spicatum (RUGKHLA et JONES , 1998); etc...
Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un milieu pauvre n'est pas
toujours indispensable pour le déroulement des différentes phases annoncées
précédemment. L'exemple des travaux de MAHESWAREN et WILIAMS, (1984),
portant sur l'embryogenèse du trèfle et la luzerne, est très significatif puisqu'ils
ont réussi à obtenir, des embryons somatiques, directement sur les explants
d'embryons immatures cultivés sur un milieu riche en cytokinine et totalement
dépourvu d'auxine. C'est l'exemple aussi des travaux de KRISTEN et al., 2000
réalisés sur les explants de pétioles de Echinecea purpurea L
Par contre d'autres cultures exigent en phase inductive, la présence conjointe
d'une auxine et d'une cytokinine, c'est le cas de la luzerne (JULLIEN, 1991); du
papayer (MONMARSON et al., 1994); du cocotier (SERGE, 1998) ; du caféier
(CARNEIRO, 1999) et bien d'autres espèces.

Il est utile de rappeler , que les auxines les plus souvent utilisées en organogenèse
ou en embryogenèse somatique sont le 2,4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de
son bon pouvoir inducteur, le 2,4 -D semble détenir, d'après EVANS et al., 1981, le
record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse somatique
(puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme régulateur). Quand
aux cytokinines , elles sont représentées par la Kinétine, , la benzyladenine (BA),
la 2- isopentenyladénine et la zéatine.
Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de croissance peuvent
intervenir dans le processus d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique tels
que les gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur utilisation
reste limiter . Les gibbérellines, selon JAYASREE et al, 2001, stimulent fortement
la production de bougeons néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles sont
combinées aux cytokinines. Par contre, d'après MARGARA, 1989, les
gibberellines ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la
rhizogenèse chez le Chou-fleur.

L'acide abscissique (ABA) quant à lui, est employé par certains auteurs dans le
but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique des embryons
(UNNIKRISHAN et al., 1990 ; DODEMAN et al., 1997). Son usage peut inhiber,
en même temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et
empêche la germination précoce des embryons somatiques MILENA et al., 1998;
SVOBODOVA et al ., 1999).
4.3.2-Influence de la source carbonée

Les tissus en cultures in-vitro sont largement hétérotrophes via à vis du carbone en
raison de l'absence ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc
indispensable d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de culture. Les
glucides remplissent deux fonctions principales dans les milieux de culture ; ils
fournissent de l'énergie nécessaire pour la croissance des tissus et maintiennent une
pression osmotique donnée du milieu de culture (ZRYD, 1988). Cette pression
osmotique, appelée aussi « effet osmoticum , peut avoir diverses actions sur les tissus.
Elle agit , dans certains cas , sur l'orientation ou l'expression morphogénétique des
tissus (BELAIZI et BOXUS, 1995; CHARNIERE et al., 1999), dans d'autres , sur la
maturation des embryons somatiques produits (WALKER et PARROTT, 2001) .
Les glucides, les plus généralement utilisés sont le saccharose et le
glucose (MARGARA,1989; DRUART et SAMYN,1995). Selon certains
auteurs, le maltose peut constituer une bonne source carbonée puisqu'il
permet , dans certains travaux portant sue l'embryogenèse, d'améliorer à
la fois, et la qualité et la quantité des embryons somatiques produits (
SAADI , 1991).
L'organogenèse ou l'embryogenèse somatique ne semblent pas être
influencées uniquement par la nature des sucres mais aussi, et pour un
même sucre, par sa concentration dans le milieu de culture.
Généralement, selon PIATTI, 1988, les doses employées oscillent entre 2
et 12 %.

L'effet dose peut avoir, comme nous l'avons signalé ultérieurement, une
grande influence sur le devenir morphogénétique des cultures. Dans ce
cas , l'exemple du tournesol est très significatif, l'usage d'une
concentration de 12% en saccharose peut orienter le processus vers la voie
de l'embryogenèse somatique, alors qu'une concentration de 3 %
conduirait vers la néoformation de bourgeons (CHARNIERE,1999).
1.2 Différenciation et dédifférenciation cellulaire

Différenciation cellulaire : Processus par lequel une cellule peu ou pas


différenciée acquiert les caractéristiques d’un type cellulaire sur le plan
morphologique et fonctionnel.
Cellules différenciées : Structure cellulaire particulière (épithélium),
production spécifique (cellule endocrine…), fonction cellulaire spécifique
(cellule musculaire, polynucléaire neutrophile, neurone…).
Une cellule capable de se différencier :
 En tous les types cellulaires d’un organisme
est dite totipotente (zygote et très jeunes
cellules embryonnaires, avant le stade
blastocyste)
=> Peut générer un organisme entier
(thérapeutique +++)
 En plusieurs types de cellules est appelée
pluripotente (cellules souches)

=>Peut s’auto-renouveler
=> Est spécialisée : cellules souches
hématopiétiques, de l’épiderme, musculaires…
Dédifférenciation cellulaire:
Est un processus participant à l'embryogenèse
somatique des végétaux, ainsi qu'une étape de régénération de
certains organes d'animaux qui peut être induite par génie
biomoléculaire
Certaines cellules peuvent retourner à l'état méristématique et
commencer à se diviser en engendrant un nouveau méristème
dont l'activité pourra donner par la suite un nouvel organe,
exemple le cas du bouturage ou de production d'autres formes
de propagules qui permet de multiplier des individus sans
passer par la reproduction ou encore celui de la formation
des racines secondaires.
Ce phénomène peut être activé par des virus ou parasites lors de
la formation de galles par exemple
1.3 Aspects moléculaires de la variation somaclonale

Variation somaclonale
Variation des caractères génotypiques parentaux de cellules
végétales somatiques en culture in vitro.
La mutagénèse et la variation somaclonale
- La mutagénèse consiste à provoquer Par cette méthode, on a pu obtenir une
artificiellement des modifications de l'ADN en variabilité pour des caractères tels que
utilisant des agents mutagènes : produits la résistance aux herbicides, la résistance aux
chimiques ou rayonnements ionisants. maladies, la tolérance au stress ou à la salinité.
Les principaux succès de cette méthode
concernent l'amélioration des plantes Ces deux techniques sont peu utilisées par
autogames. Ainsi chez le riz, une amélioration les sélectionneurs car on ne peut prévoir la
de la qualité technique du grain a pu être variabilité créée. De plus, les modifications de
obtenue. caractères obtenues sont peu stables et ne se
retrouvent pas toujours dans la plante
- La variation somaclonale est la modification régénérée, ou dans sa descendance.
observée chez certaines cellules, après un long
cycle de cultures in vitro sans régénération.
Elles ne sont plus alors identiques à la plante
mère. Cette variation peut être due à une
modification du génome nucléaire ou du
génome des organites cytoplasmiques.
La variation somaclonale, induite par une culture plus ou
moins longue des cellules en conditions artificielles, est bien connue
chez les plantes et particulièrement fréquente chez le riz. Une partie de
cette variation est due à des mutations de gènes, qui sont transmises par
voie sexuée. Ces mutations ne diffèrent pas essentiellement de celles qui
apparaissent spontanément ou sont induites par des traitements
mutagènes. Pour autant que la régénération des plantes à partir des
cultures soitefficace, la variation somaclonale est une source de diversité
complémentaire, parfois utilisable en sélection, en raison du grand
nombre de cellules susceptibles d'être atteintes. Son utilisation se justifie
surtout lorsque le caractère recherché peut être sélectionné par des
pressions appliquées aux cultures cellulaires elles-mêmes.
Les recherches entreprises envisagent des problèmes rencontrés par
le développement de la riziculture dans diverses régions d'Afrique et liés à la
composition des sols (concentrations élevées en sel ou en aluminium) et aux
basses températures (stérilité et longueur du cycle). Elles sont étroitement
associées à des programmes de sélection développés dans plusieurs pays. Leur
principal objectif est d'éliminer un caractère désavantageux existant dans un
génotype qui possède déjà une bonne adaptation aux conditions locales
Disposition de titre et de contenu avec graphique
6

0
Catégorie 1 Catégorie 2 Catégorie 3 Catégorie 4
Série 1 Série 2 Série 3
Disposition Deux contenus avec tableau
• Première puce ici Groupe A Groupe B
• Deuxième puce ici Classe 1 82 95
• Troisième puce ici
Classe 2 76 88

Classe 3 84 90
Disposition Deux contenus avec SmartArt
• Première puce ici
Tâche
• Deuxième puce ici 1

• Troisième puce ici

Groupe
A
Tâche Tâche
3 2