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CROMATROGRAFIA

• La cromatografía es el arte y la ciencia de


separar los componentes de una sustancia
Comienzos

Desarrollada
por Mikhail
Tswett, en 1906
con el fin de
separar los
colorantes que
componen a las
plantas.
xantofila, clorofila y α y β-caroteno
usó columnas de adsorción para separar
pigmentos vegetales

Fase
móvil
Pigmentos
vegetales

Tswett (1872-1919) Fase


estacionaria

Chroma: color
Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA

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Comienzos

Consistía en una columna de vidrio rellena de CaCO3 a


la cuál se le colocaba la muestra en la parte superior
y se le circulaba éter de etilo, logrando que las
sustancias más afines al solvente salieran de la
columna más rápidamente que las menos afines.
Definición

• La cromatografía es una técnica que permite separar los


diferentes componentes de una mezcla compleja.

• La cromatografía es un método analítico utilizado


ampliamente en la separación, identificación y
determinación de compuestos químicos en mezclas
complejas.

• La separación se logra por diferencias en la movilidad


relativa de los solutos, lo cual se logra por las distintas
interacciones físicas y químicas entre los componentes.
Componentes básicos de una
cromatografía
Existe una gran variedad de sistemas y técnicas cromatográficas pero
todos tienen en común la utilización de una fase móvil (FM), gas o
líquida, que transporta los componentes de la muestra a través de la
fase estacionaria (FE).

Los componentes a separar deben de ser


solubles en la FM, pero deben de ser
capaces de interaccionar con la FE.

– Fase estacionaria
– Fase móvil
– Soluto o muestra
Durante la separación cromatográfica, los analitos se
distribuyen entre las dos fases. La separación está basada
en la diferencia de velocidad de migración entre los
componentes de muestra. El movimiento relativo de cada
molécula es resultado de un equilibrio dinámico entre
dos fuerzas antagonistas:
- Las que desplazan a las moléculas en el seno de la FM.
• Las que frenan el desplazamiento por interacciones con
la FE y son de distinta naturaleza según el tipo de
cromatografía.
FASE MÓVIL

FASE
ESTACIONARIA
CROMATOGRAFÍA

Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido

Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la


fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de


manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas

α= [moléculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
Clasificaciones de cromatografía

1. Según como se encuentre la fase estacionaria

a. columna

b. batch

c. plana cromatografía en papel y en capa fina


3. Según el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fluído a presión (HPLC)


Clasificación
Se aplican varios criterios

• De acuerdo al soporte

• Al tipo de equilibrio que se establece en la


separación

• Al estado de agregación de la fase móvil


Mecanismos de separación

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
Clasificación de los métodos
cromatográficos

Mecanismos de separación.
a) Separación por adsorción (cromatografía de
adsorción)
Basada en la diferente afinidad de los componentes de
la muestra sobre la superficie de un sólido activo
(componentes con polaridad baja o media).
b) Separación por tamaño molecular
(Cromatografía de permeación de gel, de tamiz
molecular o de exclusión por tamaños).
La FE sólida es un gel poroso que retiene
moléculas dependiendo de su tamaño.
LC DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS

Bolas de gel: fase estacionaria

y : especies a separar
Las moléculas más pequeñas penetran
en los intersticios o canales del gel,
viajando a menor velocidad
Flujo de fase móvil

Las moléculas más grandes no pueden penetrar


en los canales del gel y por tanto viajan a mayor
velocidad.

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c) Separación por Intercambio iónico
La separación se basa principalmente en la
diferente afinidad de una FE sólida para el
intercambio de iones de los componentes de la
muestra.
LC DE INTERCAMBIO IÓNICO

+ Intercambiador iónico (aniónico) - y + : Especies a separar

+
- Las especies con carga negativa se unen a la resina que está
Flujo de fase móvil

+ cargada positivamente, quedando retenidas.


- +
+
- Las especies con carga positiva son repelidas por la resina
+ - siendo eluídas de la columna.
- -
+ +
+ - EQUILIBRIOS DE INTERCAMBIO
+
+ + Intercambiador catiónico:
- + xRSO3-H+ + Mx+ ↔ (RSO3-)xMx+ + xH+
+ - sólido disolución sólido disolución
+
- + Intercambiador aniónico:
xRN(CH3)3+OH- + Ax- ↔ [RN(CH3)3+]xAx- + xOH-
sólido disolución sólido disolución

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Clasificación según equilibrio

• Cromatografía de afinidad: emplea interacciones


especificas entre una clase de moleculas de soluto
y una segunda molecula que esta unida
covalentemente (inmovilizada en la fase
estacionaria)
• reacción inmunológica donde el soluto es el
antígeno y los anticuerpos se encuentran
adsorbidos en la fase estacionaria.
Cromatografía de afinidad
d) Separación por reparto (cromatografía de
reparto)
Basada en la diferente solubilidad en fases
estacionaria y móvil (Componentes con
polaridad media o alta).
Aspectos instrumentales de la cromatografía

• El cromatograma
– Tiempo de retención
Eficacia en la separación
Resolución
Difusión
Altura de plato
Factores que influyen en la resolución
Ensanchamiento de bandas
Ecuación de Van Deemter
EL CROMATOGRAMA
Si un detector que responde a la concentración de soluto se
coloca en el extremo de la columna y su señal se representa
como función del tiempo, se obtiene una serie de picos. Dicho
gráfico, llamado cromatograma, es útil tanto para el análisis
cualitativo y cuantitativo:
• Las posiciones de los picos en el eje de tiempo pueden servir
para identificar los componentes de la muestra;
• las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa
de la cantidad de cada componente.
Parámetros básicos en cromatografía.
Diversos parámetros caracterizan el proceso de
separación dinámico:
a) Retención: capacidad real de la fase
estacionaria para retardar la salida de un
componente.
b) La línea base es el registro cuando por la
columna sólo pasa FM.
c) El pico cromatográfico es la señal del
detector cuando emerge un componente de
la columna.
Parámetros
CROMATOGRAMA

Tiempo de retención= tiempo que transcurre desde la


inyección de la muestra hasta que el soluto alcanza el
detector( a veces esta magnitud se mide en volumen de
elución)

Tiempo muerto= es el tiempo Ancho del pico en la base= es el


necesario para que una especie que no tiempo transcurrido desde que
se retiene en la fase estacionaria el soluto alcanza el detector
alcance el detector hasta que lo abandona
• El ancho de pico en la base (W) es utilizado
para el cálculo del área de pico y para fijar su
altura. Ambos parámetros están directamente
relacionados con la concentración del analito
y se utilizan en el análisis cuantitativo.
VELOCIDAD DE MIGRACIÓN
DE LOS SOLUTOS
• La eficacia de una columna cromatográfica en la
separación de dos solutos depende en parte de
las velocidades relativas a las que se eluyen las
dos especies.
• Estas velocidades están determinadas por la
magnitud de las constantes de equilibrio de las
reacciones mediante las cuales los solutos se
distribuyen entre las fases móvil y estacionaria.
KD
A (mobile phase) A (stationary phase)
Relación entre tiempo de retención y
coeficiente de reparto
• Coeficiente de retención = D (coef. De
reparto)* Volumen fase estacionaria/volumen
fase móvil
La velocidad de migración del soluto
El factor de retención
• El factor de retención, o factor de capacidad,
es un parámetro importante que es
ampliamente utilizado para describir las
velocidades de migración de los solutos en
columnas.
• capacity factor is useful for comparing results
obtained on different systems since it is
independent on column length and flow-rate.
Factor de retención (k) = factor que se puede determinar
experimentalmente y permite comparar la velocidad
de migración de los diferentes solutos.

k= Tr – Tm
Tm

IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenido


k entre 1 y 5 valor ideal
k 20 o mayor cromatografías muy largas
COMPARACIÓN DE LA EFICACIA DE
LAS COLUMNAS
Eficacia
• El objetivo principal de la cromatografía es
separar los componentes de una mezcla
• La separación de los componentes depende:
– del ancho de los picos y
– del espacio de tiempo entre los picos
Martin y Synge en 1941 desarrollaron los
aspectos teóricos de la separación
cromatográfica. La llamada Teoría de platos está
basada en procesos de destilación, tratando la
columna como un sistema estático en equilibrio
formado por una serie de estrechas capas
horizontales (platos teóricos). En cada plato se
produce una interacción o equilibrio entre el
soluto y la FE
Métodos para describir eficiencia de la
columna
Dos términos relacionados son ampliamente utilizados como
medidas cuantitativas de la eficiencia de la columna
cromatográfica :
(1) altura de plato H y
(2) numero de platos N.
Los dos están relacionados por la ecuación
N=L/H
donde L es la longitud (generalmente en centímetros) del
relleno de la columna.
La eficiencia de columnas cromatográficas aumenta a medida
que el numero de platos se hace más grande y la altura de
platos se hace más pequeña.

N compara la eficiencia de columnas con diferentes largos


ANCHURAS CARACTERÍSTICAS
wi
tr

Punto de
Respuesta del detector

inflexión

wh

t=0 Tiempo
Inyección
wb Fig.1

wi = 2σ wb = 2wi
wh = 2,35σ
wb = 1,7wh
wb = 4σ 38
EFICACIA DE UNA COLUMNA: H, L

L
N
H
«Martin y Synge»
L

 wb = 4σ 2
2
 tR 
H L
N  16  
L N  wb 
H
La eficiencia de columnas cromatográficas aumenta a
medida que el numero de platos se hace más grande
y la altura de platos se hace más pequeña. 39
N = 16 (tR/Wb)2

N = 5.54 (tR/W1/2)2

W1/2

Esta relación compara el ancho de la banda con el tiempo


transcurrido entre la inyección y la detección
Poder de separación de las columnas

Concepto de Plato Teórico (N)

longitud de
Altura del plato (HEPT) H= L la fase
N estacionaria
Ejemplo
Cual será el número de platos teóricos y la altura
equivalente de un plato para una columna de 30
cm si el cromatograma para la determinación de
dichos parámetros mostró los siguientes
resultados:

Tr=22,3
W=1.12 N=16 x(22.3/1.12)2=6342

HEPT=L/N=30/6342
H=0.004 cm
• A solute with a retention time of 407 s has a
width at the base of 13 s on a 12.2 m long
column.
• N = 16 * 4072/ 132 = 1.57 X 104.
• H = 12.2 / 1.57 X 104 = 0.78 mm;