Biossegurança na

manipulação de
Microorganismos
 Definição

● “Biossegurança é o conjunto ações voltadas para a prevenção,

minimização ou eliminação de riscos inerentes ao ambiente de trabalho,
riscos que podem comprometer a saúde do homem, dos animais, do meio
ambiente ou a qualidade dos trabalhadores envolvidos” (TEIXEIRA E
VALLE, 1996).

O termo biossegurança vem sendo empregado desde a década de 80,

com o significado de práticas preventivas para o trabalho em contenção a nível
laboratorial, com agentes patogênicos para o homem, segundo a OMS.
 Definição: Risco Biológico
AGENTES BIOLÓGICOS: são introduzidos nos processos
de trabalho pela utilização de seres vivos ( em geral
microorganismos) como parte integrante do processo
produtivo, tais como vírus, bactérias, fungos etc,
potencialmente nocivos ao ser humano.

A avaliação de risco de agentes biológicos considera

critérios que permitem o reconhecimento, a identificação e
a probabilidade do dano decorrente, estabelecendo a sua
classificação em classes de risco distintas de acordo com
a severidade dos danos.
 Histórico
1700- Bernardo Ramazzini originou o estudo de riscos biológicos aos
profissionais de saúde.

1856- Florence Nightingale formou procedimentos profiláticos para infecções

hospitalares, como limpeza dos hospitais e higiene dos pacientes.

1867- Joseph Lister tratou ferimentos cirúrgicos com fenol.

1876- Robert Koch descreveu os Postulados de Koch.
1960- Formação das primeiras diretrizes de Biossegurança, elaboradas pelo
Center for Diseases Control (CDC) e National Institute of Health (NIH).
1976- Incorporação dessas diretrizes pela comunidade científica brasileira.

1982- Criação da primeira Insulina geneticamente modificada

1988- Divulgação da primeira legislação de Biossegurança brasileira.
 Biossegurança: Risco
Biológico
CBS: Instrução Normativa n°7/97 “Diretrizes Gerais para o Trabalho em Contenção
com Material Biológico”,onde apresenta normas de Biossegurança laboratorial para
manipulação de agentes patogênicos, e sua classificação de acordo com critérios de
patogenicidade, alteração genética ou recombinação gênica; estabilidade; virulência;
modo de transmissão; endemicidade; conseqüências epidemiológicas; e disponibilidade
de medidas profiláticas e de tratamento eficaz

PORTARIA Nº 1.914, DE 9 DE AGOSTO DE 2011, que aprova a Classificação de Risco dos Agentes Biológicos
elaborada em 2010, pela Comissão de Biossegurança em Saúde (CBS), do Ministério da Saúde
 Níveis de Biossegurança
Existem quatro níveis de biossegurança: NB-1,
NB-2, NB-3 e NB-4, crescentes no maior grau de
contenção e complexidade do nível de proteção,
que consistem de combinações de práticas e
técnicas de laboratório e barreiras primárias e
secundárias de um laboratório.

Nível de Biossegurança 1 (NB-1):

● Nível de contenção laboratorial que se
aplica aos laboratórios de ensino básico,
onde são manipulados os microrganismos
pertencentes a classe de risco 1.

● Não é requerida nenhuma característica de

desenho, além de um bom planejamento
espacial e a adoção de boas práticas
laboratoriais.
 Níveis de Biossegurança
Nível de Biossegurança 2 (NB-2):
● Laboratório em contenção, onde são
manipulados microrganismos da
classe de risco 2.

● Se aplica aos laboratórios clínicos ou

hospitalares de níveis primários de
diagnóstico, sendo necessário, além
da adoção das boas práticas, o uso de
barreiras físicas primárias (cabine de
segurança biológica e
equipamentos de proteção
individual) e secundárias (desenho e
organização do laboratório).
Níveis de Biossegurança
Nível de Biossegurança 3 (NB-3):
● Destinado ao trabalho com microrganismos
da classe de risco 3 ou para manipulação de
grandes volumes e altas concentrações de
microrganismos da classe de risco 2.

● São requeridos além dos itens do nível 2,

desenho e construção laboratoriais especiais.

● Deve ser mantido controle rígido quanto a

operação, inspeção e manutenção das
instalações e equipamentos e o pessoal
técnico deve receber treinamento específico
sobre procedimentos de segurança para a
manipulação destes microrganismos.
 Níveis de Biossegurança:
Nível de Biossegurança 4 (NB-4):
● Laboratório de contenção máxima,
manipulação de microrganismos
da classe de risco 4.

● Representa uma unidade

geográfica e funcionalmente
independente de outras áreas.

● Esses laboratórios requerem,

além dos requisitos físicos e
operacionais dos níveis de
contenção 1, 2 e 3, barreiras de
contenção (instalações, desenho
EPis, Epcs) e procedimentos
especiais de segurança.
 Epidemiologia
Infecções adquiridas em Laboratórios:
-8% proveniente de laboratórios de pesquisa (não clínicos)
- vírus – 70% laboratórios de pesquisa (32% animal)
- bactéria – 43% laboratórios de pesquisa (Brucella, E. coli)
- fungos – blastomicoses, infecções pulmonares (inalação)

-60% por inalação

-40% por ingestão,
perfuro-cortantes,
contato direto, contato indireto, etc

Fonte: Pedrosa; Cardoso (2011)

WASHINGTON - Durante a limpeza de um pequeno cômodo num centro de
pesquisa de Washington, cientistas americanos encontraram, por acaso,
frascos abandonados com o vírus da varíola. Estima-se que os frascos datam
de 1950; eles estão intactos e selados. A informação foi divulgada nesta terça-
feira pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) americano.
 Biossegurança - Vírus

● Transmissão: via respiratória e sexual; água e

alimentos; contato com sangue e seus derivados;

● Laboratório e manejo de pacientes → vírus de

propagação respiratória (ex. hantavírus);

● Prevenções: percepção do risco das operações a

serem estabelecidas;

● Concentração e purificação de suspensões virais de

alto risco → aumento do nível de classificação de risco
○ Hepatite : nível 2 → nível 3;
○ Hantavírus: nível 3 → nível 4.
 Biossegurança - Vírus
● Classe 2
○ Herpesviridae (Herpes simples; Varicela Zoster;
Herpesvirus Simiae, Citomegalovírus (CMV); Vírus Epstein-
Baar (EBV))
■ aproximadamente 100 nm;

■ infecção latente e persistente → podem induzir a

transformação celular;

■ Cuidado - H. Simiae → infecção assintomática em

macacos e infecção severa em humanos (NB2);

■ Não há vacina;
 Biossegurança - Vírus

■ Cuidados especiais devem ser tomados na

manipulação de macacos;

■ Herpes simplex e Varicella zoster podem causar

infecções em animais de laboratório.

■ Os herpesvirus são sensíveis aos solventes

orgânicos (etanol, éter, clorofórmio, acetona),
sensíveis a pH inferior a 5 e podem ser inativados a
37ºC por 60 minutos ou 30 minutos a 56ºC. A luz UV
pode inativá-los em 5 minutos.
 Biossegurança - Vírus
● Classe 3
○ Retroviridae (HIV-1, HIV-2, SIV, HTLV-I E HTLV-II)
■ vírus RNA de 80 a 100 nm;

■ Risco de infecção laboratorial baixo;

■ Risco maior é apresentado por inoculação parenteral

acidental, seguido de exposição por contato com
feridas;

■ CUIDADO: O vírus se mantém potencialmente

infectante em sangue ou derivados sangüíneos
secos por vários dias. Seguir as regras para NB-3.
 Biossegurança - Vírus
● Retrovírus são em geral inativados por produtos clorados:
1% de cloro ativo são indicados para limpeza e/ou
descontaminação de áreas físicas (bancadas,
equipamentos).

● Outros produtos usados com frequência são o álcool a 70%

(OBS: etanol 70% leva 10 minutos para matar HIV).

● Os retrovírus são sensíveis a extremos de pH (< 2 ou >12),

ao calor seco 170º C / 2 horas (forno), calor úmido sob
pressão 121º C / 20 min (autoclave) ou fervura por 20 min.

● Soros podem ser inativados a 56º C / 30 min (OBS:

inativação dos soros pode levar a queda do título de
anticorpos).
 Biossegurança - Fungos
Grande risco de se expor e adquirir uma infecção
micótica:
● Contaminação pela inalação de esporos ou de
partículas infecciosas;
● Inoculação percutânea causada por acidentes com Para minimizar estes
agulhas e bisturis; e outros riscos
práticas
laboratoriais
Doenças micóticas não infecciosas tais como adequadas devem
micotoxicose pulmonar e hipersensibilidade micótica: ser utilizadas no
● A micotoxicose pulmonar: doença respiratória ambiente de trabalho
aguda por inalação esporos fúngicos (micotoxinas
produzidas pelas espécies de Aspergillus spp,
Claviceps spp, Fusarium spp, Penicillium spp.)
● A hipersensibilidade micótica: pneumonia
causada por uma reação imunológica em pessoas
susceptíveis e requer repetidas exposições ao
agente.
 Biossegurança: Fungos
.
Classe de risco: 2
● Cryptococcus neoformans
1. Levedura patogênica, uni
ou bibrotantes,
encapsulados.
2. Em cultivo, não apresenta
diferença morfológica
evidente.
3. A criptococose é adquirida
por inalação de propágulos
de leveduras desidratadas
e/ou basidiosporos (da
forma perfeita do fungo) a
partir de fontes ambientais
4. Na maioria dos casos
ocorre infecção pulmonar
regressiva.
➔ Transmissão: A inoculação parenteral
acidental de culturas ou outros
materiais contaminados, mordidas de
camundongos infectados,
manipulação de materiais ambientais
infectados(fezes pombos) e contato
com material contaminado com urina
de animais, especialmente em
imunocomprometidos
➔ NB-2: Nas instalações do laboratório
e na prática de trabalho com
materiais clínicos potencialmente
infecciosos, com culturas, com
animais infectados
experimentalmente, processamento
de solo. .
 Biossegurança: Fungos
Classe de risco 3:
● Histoplasma capsulatum
➔ A histoplasmose pode ser
uma micose pulmonar
1. Fungo dimórfico: a 37°C,
aguda, subaguda, crônica
apresenta-se em cultura ou tecido
ou sistêmica
parasitário (forma leveduriforme)
➔ Transmissão: manuseio de
2. O aspecto saprofítico é
culturas na forma micelial e
caracterizado por uma côlonia
as infecções locais de
algodonosa de crescimento
ferimentos na pele.
rápido, inicialmente branco, com
➔ NB-3: manipulação culturas
conídios.
filamentosas identificadas
3. A inalação de conídios e
como H. capsulatum,
fragmentos miceliais é modo de
processamento de solo ou
infecção mais importante.
outro material ambiental
4. O nicho ecológico do H.
conhecido ou que
capsulatum é o solo e restos
provavelmente contenham
orgânicos contaminados com
conídios infecciosos
fezes de galinha, morcego ou
pássaros.
.
 Biossegurança - Bactérias
● Transmissão: Amostras de fluidos corporais e de fezes são
potencialmente infecciosos.
● Risco é elevado ao trabalhar com material clínico desconhecido
● Evitar a exposição através de medidas de biossegurança e assim
evitar conseqüente infecção.

● Riscos são influenciados por:

Agente Atividade
infectante: Hospedeiro: Atividade
Virulência Idade Desempenhada:
Carga Sexo Diagnóstico
infectante Gravidez Produção
Ciclo Uso de antibióticos Pesquisa
Toxigenicidade Nutrição
Imunidade
Biossegurança: Bactérias
 Biossegurança: Bactérias
Classe de risco 2:
● Escherichia Coli Enteropatogênicas:
1) EPEC - E. coli enteropatogênica - causa
➔ A infecção: contato direto
diarréia em crianças
pessoa a pessoa e do
2) ETEC - E. coli enterotoxigênica - diarréia consumo de água e
aquosa semelhante à desencadeada pelo Vibrio alimentos contaminados.
cholerae.
3) EIEC - E. coli enteroinvasora - disenteria ➔ Transmissão: ingestão
semelhante à provocada pela Shigella sp. do micro-organismo e/ou
4) EHEC - E. coli enterohemorrágica - principal inoculação parenteral
agente da colite hemorrágica e da síndrome
hemolítica urêmica, produzem citoxinas para ➔ Procedimentos para a
células VERO. manipulação de micro-
organismos patogênicos
5) EAggEC - E. coli enteroagregativa - associada e/ou recombinantes: NB-
a casos de diarréia crônica, possui um padrão de 2.
aderência específico para as células HEp-2.
 Biossegurança: Bactérias
Classe de risco 2:
● Neisseria gonorrhoeae:
1. Coco Gram negativo pequeno,
não móvel, se dispõe aos pares
(diplococos)
1. Cresce em meio de cultura
específico com 10% de CO2 .
Os gonococos são lábeis nas
condições ambientais e as
amostras devem ser semeadas
rapidamente.
1. Usualmente, o período de
incubação é de 2-7 dias.
➔ Foram relatados nos EUA
quatro casos de infecção
laboratorial por gonococo
➔ Trasmissão: contato direto ou
indireto das mucosas e/ou por
inoculação parenteral
acidental do microorganismo
➔ NB- 2 é indicado para o
trabalho com material clínico
e cultura,
➔ NB- 3 quando o trabalho
envolve produção de
aerossóis ou culturas em
larga escala
 Biossegurança: Bactérias
Classe de risco 3:
● Mycobacterium tuberculosis, M.bovis: ➔ Via de transmissão:
Respiratória, exposição a
1) Bacilo aeróbio, imóvel, álcool ácido aerossóis (em laboratórios)
resistente
2) Cresce em meios de cultura específicos, ➔ Máscaras com filtro HEPA
crescimento lento devem ser usadas durante a
3) Dose infectante: aproximadamente 10 manipulação de M.
bacilos. tuberculosis.
4) A bactéria é encontrada em escarro,
lavado gástrico, secreções do trato ➔ NB-3 é indicado:
respiratório, urina e em tecidos afetados. identificação de
5) M. bovis apresenta maior risco para micobactérias, teste de
indivíduos imunossuprimidos ou sensibilidade a
portadores de HIV. antimicrobianos e manuseio
de grandes volumes de
culturas concentradas.
 Biossegurança: Bactérias
Classe de risco 3: ➔ Transmissão: Contato direto
● Yersinia pestis com material infeccioso
proveniente de humanos e
1. BGN da família Enterobacteriaceae, roedores, aerossóis
agente etiológico da peste bubônica. infecciosos gerados durante
2. Concentra na forma endêmica, a manipulação de culturas,
principalmente em alguns estados tecido .
da região nordeste (Piauí, Ceará, ➔ NB-2: manipulação de
Pernambuco, Paraíba e Bahia). culturas em pequena escala
3. Pode estar presente no sangue, ou material clínico
escarro, líquido céfalo-raquidiano, potencialmente infectado
fezes, e urina de humanos.
➔ NB- 3: grandes volumes de
4. Risco de infecção laboratorial: rara,
cultura, quando os
porém comprovada. Quatro casos
bastonetes são resistentes
foram relatados nos Estados Unidos
da América. ou em atividades com
potencial de gerar aerossóis.
 Organismos geneticamente
modificados: Vantagens
Tolerância a Herbicidas – Aumento da produtividade: plantas com
resistência a produtos químicos como pesticidas e inseticidas
altamente utilizados no combate as pragas.

Tolerância a Insetos – Redução dos químicos usados: culturas

transgênicas podem possuir genes de resistência as pragas,
produzindo toxinas que matam esses insetos e contribuir assim para
o menor uso de produtos químicos.

Redução do Uso de Fertilizantes: OGM munidos de genes que

permitem aumentar seu tamanho sem uso de fertilizantes.

Melhoria da Qualidade dos Alimentos: alimentos com maior teor

de nutrientes, vitaminas, aumentar o tempo de prateleira dos
produtos.
 Organismos geneticamente
modificados: Vantagens
Produção de Compostos com Interesse Econômico: queijos,
leites, enzimas, etanol

Clonagem: DNA recombinante

Produção de Medicamentos

Diminuição a fome mundial: Os transgênicos permitiram um

maior aproveitamento de culturas e principalmente a concepção
de alimentos mais ricos em nutrientes e vitaminas.

Erradicação de doenças
 Organismos geneticamente
modificados: Desvantagens

Poluição do Ambiente Perigo para a Saúde

Pública
Redução da Biodiversidade: afeta
os níveis da cadeia alimentar Resistência a Antibióticos

Poluição Genética: clones de OMG Insegurança na Utilização

contaminam populações selvagens dos Transgênicos:
estudos curtos e
Aumento das Alergias superficiais

Aparecimento de novas doenças Falta de Informação

 Aplicações da Tecnologia
do DNA recombinante
A Tecnologia do DNA recombinante tem uma ampla
aplicação:
● Produção de substâncias úteis: insulina humana,
hormônio de crescimento, vacinas, enzimas industriais
em grandes quantidades
● Estudo de mecanismos de replicação e expressão
gênica, etc;
● Investigação de paternidade;
● Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas;
● Terapia gênica;
● Transgênicos
 Técnicas DNA
recombinante
Para introdução em uma célula hospedeira:

Transformação CaCl2:
→ As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de
cálcio e sofrem um choque térmico.
→ Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA
e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela
membrana.

Eletroporação:
→ Técnica na qual se misturam bactérias e o vetor num único tubo e
aplica-se um choque eléctrico na mistura → desestabilizar a membrana e
permitir a entrada do vetor na bactéria.
→ Ela é então rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a
37ºC para que se possa recuperar após o choque.
 Organismos Geneticamente
Modificados: Bactérias

● Escherichia coli → 1º organismo usado na tecnologia do

DNA recombinante;

● Insulina artificial/recombinante → 1º produto comercializado

mundialmente;

● Construção do gene sintético para a pró-insulina humana foi

iniciada a partir da sequência de aminoácidos dessa
proteína;

● Utilizando - se os códons genéticos para E. coli para uma

melhor expressão do gene nessa bactéria, foi montado um
gene codificando a proteína humana
 Organismos Geneticamente
Modificados: Bactérias

→ Introdução do gene sintético da pró-insulina humana em

plasmídeos;

→ Corte do DNA plasmidial com enzimas de restrição;

→ Ligação do gene inserido através da DNA ligase;

→ O plasmídeo modificado é inserido em bactérias (E. coli);

→ Reprodução;

→ Replicação do gene da insulina;

→ Purificação e filtração para eliminação de contaminantes.

Histórico
 Organismos geneticamente
modificados: Fungos

Saccharomyces cerevisae

amido glicose
sacarificação do amido
Linhagem industrial - 0% de etanol Aspergillus awamori → glico-amilase
Nova linhagem - 89,8% de etanol Debaromyces occidentalis → α-amilase
 Organismos Geneticamente
Modificados: Vírus
→ A tecnologia do DNA a partir dos anos 70
trouxe as primeiras iniciativas na direção do
desenvolvimento de vacinas recombinantes.

→ Iniciativa mais importante e bem sucedida

da indústria do DNA foi a vacina recombinante
contra a hepatite B licenciada nos Estados
Unidos no ano de 1987.

→ Antígeno HbsAg, pode ser produzido em

diferentes hospedeiros como Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisiae e Picchia pastoris
 Organismos Geneticamente
Modificados: Vírus

→ Obtida pela expressão do gene

viral que codifica a proteína HbsAg,
em P. pastoris.
→ Gene viral é ligado a um
plasmídeo contendo um promotor
de leveduras constitutivo, de
maneira que o gene é expresso
pela levedura durante toda a
duração do processo fermentativo.
→ O produto da expressão do gene
viral é extraído, separado e
finalmente purificado por processos
separativos.
 Organismos Geneticamente
Modificados: Vírus
Novas Abordagens para o desenvolvimento de Vacinas:
→ Em decorrência de avanços na tecnologia do DNA,
seqüenciamento de genomas, genomica, bioinformática, proteomica,
no entendimento do sistema imune e, particularmente, a busca por
vacinas de composição química definida.

→ São as chamadas vacinas gênicas ou vacinas de DNA: os genes

para o antígeno de interesse são localizados e clonados.

→ Diferença: DNA é injetado diretamente no músculo da pessoa ou

animal a ser vacinado, com uma espécie de pistola de ar comprimido
que espalha o DNA nas células musculares.

→ Ao absorver o DNA com o código do antígeno de interesse, as

células musculares passam a expressá-lo, desencadeando, assim, a
desejada resposta imunológica.
 Organismos geneticamente
modificados: Algas
→ Tecnologias para mitigação do CO2
Uso de microalgas e cianobactérias

Spirulina platensis

Fixação biológica de CO2 através de fotobiorreatores

alimentados com culturas.
 Organismos geneticamente
modificados: Algas
→ Isobutanol

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.18; p. 2014

 Organismos geneticamente
modificados: Algas

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (DF); Instituto

Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH, sigla em inglês) e
a Universidade de Londres:

Comprovação do uso de sementes de soja geneticamente

modificadas como uma opção viável e eficiente para a produção
em larga escala da cianovirina (proteína extraída de algas)
muito eficaz no combate à AIDS.
Revista Science, n. 6223, v. 347 p. 733, seção Editors choice, 2015