Introducción a la espectroscopía
vibracional
1. .Conceptos básicos
 Estados vibracionales y energía
 Modos normales de vibración
 frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas
 Espectroscopía infrarroja 3.
 Regiones del IR
 Grupos funcionales
 "Huellas digitales"
 Número de ondas e intensidad
 Reglas de selección
 FTIR y sus ventajas
 Espectroscopía Raman
 Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes)
 Reglas de selección
 Ventajas sobre el IR
 Resonanacia Raman
.Aplicaciones a proteínas
 Análisis de estructura
secundaria
 Cálculos
 Asignaciones
 Uso de isótopos
 Grupos laterales
1
Bibliografía

 Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin

Cummings (1984)
 Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2,
(1984).
 Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and
Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem.
38; (1986), p. 180
 Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform
Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p
290
 Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman
Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

2
 Introducción a la espectroscopía
vibracional
Espectro electromagnético

Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición

Frecuencia (Hz)
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear
1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos
1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos
4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos
1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones
108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones
100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin
3
E Estados vibracionales y energía

Distancia internuclear

4
3
2
1
1 k

0
Frecuencia de la vibración
2 
k = constante de fuerza del enlace F = -kx
m1m2
µ = masa reducida, para un sistema diatómico  
m1  m42
Modos normales de vibración (3N - 5)

cm-1 IR RAMAN

estiramiento
O C O 1340 - +
(sim)

estiramiento
O C O 2349 + -
(asim)

deformación O C O
667 + -

deformación O C O 667 + -

5
Técnicas: INFRARROJO
Reglas de selección:

No todas las vibraciones serán “activas”

en IR

Sólo aquellas en las que cambie el

momento dipolar permanente durante la
vibración
6
INFRARROJO

7
 O

NH CH3
INFRARROJO

N-H C-H

C=O

8
 FTIR
Espectrometría IR con
Transformada de Fourier
1. Mejor relación señal/ruido ya
que la luz no debe pasar por un
monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias
a la vez lo que da mucha mayor
rapidez
3. Puede tener una resolución de
menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan
necesariamente por una
computadora lo que facilita el
análisis y manejo espectral 9
 Modos normales de vibración del grupo amida
(valores para metilacetamida)
C H C H C H C H

C N C N C N C N

O C O C O C O C
estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M)

C H

C N C H C H C H

C N C N C N

O C O C O C O C

amida IV (627 D) amida V (725 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M)

C H C H C H C H

C N C N C N C N

O C O C O C O C
estiramiento NC estiramiento CN y CC deformación CCN 10
deformación CNC
(1096 D) (881 D) (436 D) (289 D)
11
 Estructura secundaria

ovillo estadístico

hélice a

transición a  b

b antiparalela

Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. 12

J Biol
Chem (1967) 242, 5460-5466
 Estructura secundaria
Estructura a

Estructura b
Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and13
Raussens, V
Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957
 Porcentajes de hélice y cadena
extendida obtenidas por rayos X y FTIR

Proteína % Hélice % Cadena

extendida
FTIR RX FTIR RX
Carboxipeptidasa 40 39 33 30
α-Quimotripsina 12 10 50 49
Concanavalina A 4 2 60 60
Lisozima 41 45 21 19
Papaína 27 29 32 29
Ribonucleasa A 21 22 50 46

14
15
1H O
Uso de isótopos
2

C H

C N

O C

2H O
2

Efecto de la deuteración de la
proteína sobre la posición de la
banda amida I

J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

16
 Uso de
isótopos

BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa

1682 C=O amida I (hoja b)
Asignación tentativa de 1660 C=O amida I (giro)
las diferentes bandas en 1651–1652 1652 C=O amida I (hélice a)
el espectro FTIR de
1633 1633 C=O amida I (hoja b)
BIAP y apoBIAP en
2H O, pH 6.6 1586–1577 1586–1571 C=O COO– Asp o Glu
2
1547 1547 d N-H amida II
1516–1517 1516–1517  OH anillo Tyr 17
1443 1455 d N-2H amida II y 2HOH
 Uso de
isótopos
C H

C N

O C 1 = 27 min
2 = 63 min
3 = 180 min
4 = 21 h

Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1

18
Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)
Isótopos y posición de las bandas

FTIR de monóxido
de carbono unido a
citocromo c aa3 de
T. termophilus.

19
Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.
Unión de ligandos

20
 Técnicas: Raman
Dispersión inelástica de fotones
estados electrónicos virtuales

Sir Chandrasekhara Venkata Raman,

(சந்திரசசகர வெங் கடராமன் )
Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888
Bangalore, Karnataka - 21/11/1970

Premio Nobel de Física 1930

21
 muestra
Láser, luz monocromática

Regla de selección:
Para que la vibración sea
Monocromador,
activa en Raman debe
provocar un cambio en la espectrógrafo
polarizabilidad de la
molécula.

Ventajas de Raman con respecto a IR

1. Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho
más sensibles
2. El agua produce una dispersión Raman muy débil
3. La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a
cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor 22
N N

23
24
25
 Resonancia Raman

estado electrónico excitado

estado energético virtual

Resonancia
Raman Raman

estado electrónico basal

La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman,

pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las
bandas debidas al cromóforo
26
l = 406.7 nm

Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998).

27 Eur
J Biochem 254(3): 662-70
 [hemo] = 0.34 mM
[SO42-] = 400 mM
SO42-

Spiro, T. C. and Strekas, T. G.

(1973) JACS 96: 338

28
Uso de isótopos

Unión de óxido nítrico a

superóxido reductasa de
Pyrococcus furiosus

l = 476 nm

29
Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en
solución en amortiguador de fosfato (rojo).

30
 Infrarrojo y Raman
• El fenómeno de absorción • Se mide en el visible o UV
es más intenso por lo que donde los detectores son
se requieren muestras mucho más sensibles
menores • El agua produce una
• El equipamiento es más dispersión Raman muy
sencillo y de uso más débil
flexible • El Raman resonante
• No presenta interferencias permite sondear grupos
con otros fenómenos asociados a cromóforos
físicos (p. ej. con una sensibilidad
fluorescencia) varios órdenes de
magnitud mayor

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 Introducción a la espectroscopía
vibracional
1. .Conceptos básicos
 Estados vibracionales y energía
 Modos normales de vibración
 frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas
 Espectroscopía infrarroja 3.
 Regiones del IR
 Grupos funcionales
 "Huellas digitales"
 Número de ondas e intensidad
 Reglas de selección
 FTIR y sus ventajas
 Espectroscopía Raman
 Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes)
 Reglas de selección
 Ventajas sobre el IR
 Resonanacia Raman
.Aplicaciones a proteínas
 Análisis de estructura
secundaria
 Cálculos
 Asignaciones
 Uso de isótopos
 Grupos laterales
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