Universidad Mayor San Simón

Facultad de Medicina
Segundo Año

Dra. Rosse Mary Yañez Villanueva MSc. P.hD

Fac. Medicina UMSS 2017
• Avances de los conocimientos en el campo
de la genética
• Interrelación con el desarrollo tecnológico
• Tecnología del ADN recombinante
 CONTENIDOS
1. Recombinación genética
2. Procedimiento general de clonación
3. Obtención de genes específicos
4. Recombinación in vitro
5. Transformación
6. Selección del gen recombinado
7. Procedimientos de expresión
8. Aplicaciones, riesgos y perspectivas
de la Ingeniería genética
 TEMAS ABORDADOS

Expresión de la IG y su regulación

Transcripción Traducción

Replicación

ADN ARN PROTEÍNAS

Daño al ADN Enfermedades moleculares

y mutaciones
Proceso mediante el cual se produce el intercambio
de grandes segmentos de ADN

Principal mecanismo evolutivo

(explica la gran diversidad de organismos
de una especie)
 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
Requiere la presencia de grandes segmentos de
homología entre la molécula de ADN donante y
la receptora

TIPOS DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA

TRANSFORMACIÓN CONJUGACIÓN
TRANSDUCCIÓN
 TRANSFORMACIÓN

Molécula de ADN del medio, liberada por

otra bacteria, que es captada e
incorporada al cromosoma bacteriano
Experimentos de Oswald Avery, Colin MacLeod y
Maclyn McCarty (1944)
 TRANSDUCCIÓN

Un virus asimila un segmento de

ADN de una célula infectada y lo
transfiere a otra que lo Incorpora
a su genoma.
 CONJUGACIÓN

Traspaso de segmentos de ADN circulares

(plásmidos) entre bacterias
CONJUGACIÓN
 RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA

No requiere la existencia de homología entre

la molécula de ADN donante y la receptora
 RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA

Cuando un virus infecta a una bacteria y el

ADN viral se integra al bacteriano
 RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA
Establecimiento de la lisogenia: bacteriófago 
RECOMBINACIÓN INTEGRATIVA EN EL FAGO LAMBDA
 TRANSPOSICIÓN

Un segmento de ADN migra de una parte

a otra de la molécula, o de un cromosoma a otro
en los organismos diploides
 Técnica que permite unir moléculas de ADN in vitro

Ha revolucionado el estudio de la genética de los

Eucariontes y ha proporcionado fuentes de
proteínas específicas.
 SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

• Factor trascendente en la evolución pues

permite la adquisición de nuevos caracteres que

pueden representar ventaja selectiva.

• En organismos con reproducción sexual

representa el mecanismo fundamental para la

creación de nuevos genotipos por redistribución

de genes parentales (meiosis).

 SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

• Mecanismo de defensa contra las mutaciones

dañinas haciendo perdurables las beneficiosas.

• Entre células somáticas embrionarias contribuye

a la gran diversidad de inmunoglobulinas

formadas por células linfoides.

SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA RECOMBINACIÓN

Uno de los principales mecanismos que

intervienen en la gran variabilidad de los
seres vivos
1- La recombinación genética consiste en el intercambio
de grandes segmentos entre dos moléculas de ADN.

2- La recombinación genética puede ser homóloga

(transformación, transducción y conjugación) o
heteróloga (recombinación sitio-específica,
transposición), según el requerimiento de secuencias
homólogas entre la molécula donante y la receptora.
3- La recombinación genética desempeña un papel

esencial en la evolución y constituye un mecanismo

de defensa al separar las mutaciones beneficiosas de

las dañinas.
3. Procedimiento general de clonación
 CLONACIÓN
• La clonación es el proceso por el que se
consiguen un duplicado genético, muchas
copias idénticas de un mismo segmento
gen (clones) u organismo

• Copia idéntica de un organismo ya

desarrollado de forma asexual .

• Se pueden clonar organismos pluricelulares,

células o genes
 ETAPAS

1- Obtención de un segmento de ADN (gen) a partir

del genoma de un organismo dado.
CORTE: (en sitios específicos con endonucleasas de
restricción),

2- UNIÓN de este gen a una molécula de ADN plasmido

(ligasa) capaz de replicarse en una bacteria.

3- Establecimiento de un medio adecuado que permita

la propagación de la unidad de ADN así formada.
 gen
Recombinación
in vitro vector
Obtención del gen
específico (plásmido
bacteriano)

transformación

hospedador
(bacteria)
La Clonación se basada en la transferencia nuclear, en la
que participan dos células; la del individuo donante (su
material genético) y la que lo acepta.
 TIPOS DE CLONACIÓN
 Terapéutica ( transplantes)
 Reproductiva
 APLICACIONES DE LA CLONACIÓN

INVESTIGACIÓN APLICACIONES

CLONAR
FABRICAR VACAS,
FRENAR EL APLICACIONES
TEJIDOS U CABRAS Y
ENVEJECIMIENTO TERAPEUTICAS
ORGANOS OBEJAS
A PARTIR DE
COMBATIR A PARTIR DE
ENFERMEDADES
DETECCIÓN Y CELULULAS
MADRE LECHE PURA
TRATAMIENTO

PARA CON
CLONAR COMBATIR EL
ESPECIES Transplantes CANCER PROTEÍNAS
DESAPARECIDAS HUMANAS
 POR QUÉ ES POSIBLE LA CLOANACIÓN?

Un determinado animal está compuesto por millones de

células, Esas células tienen aspectos y funciones muy
diferentes. Sin embargo todas ellas tienen algo en común: en
sus núcleos presentan unas largas cadenas que contienen la
información precisa de cómo es y cómo se organiza el
organismo: el ADN.
CLONACIÓN HUMANA
El objetivo de la investigación de la
clonación humana nunca ha sido el
de clonar personas o crear bebés de
reserva.

La investigación tiene como objetivo

obtener células madre (terapia
celular.) para curar enfermedades;
más específicamente, de la
posibilidad de clonar ciertos tipos de
células. Por ejemplo, se podrían
clonar neuronas productoras de
dopamina para curar la enfermedad
de Parkinson.
CLONACIÓN HUMANA
clonación con fines terapéuticos,
por ejemplo: clonar órganos para
hacer trasplantes ya que no existiría
los problemas de rechazos

Permitiría posibilidades de
manipulación genética.
Las células en cultivo son un material
muy adecuado para introducir o
eliminar determinados genes y se
ampliarían mucho las posibles
modificaciones genéticas que las
técnicas actuales no permiten.
 CLONACIÓN ANIMAL
• Por clonación animal, han sido clonados
varios animales como ranas, ratones, ratas,
yeguas, cerdos, etc.
• La clonación animal más famosa fue la
clonación de la oveja Dolly.

• Desde el punto de vista técnico, los animales

clonados también han presentado problemas:
además de presentar un porcentaje mayor de
malformaciones, padecen con frecuencia un
síndrome que se manifiesta en que su tamaño
es mayor de lo normal, y que tiene
consecuencias negativas para su salud y
desarrollo.
CLONACIÓN DESDE EL PUNTO DE
VISTA RELIGIOSO
• Tras la intervención realizada por los científicos
Ian Wilmut y Keith Campbell en la Oveja Dolly,
el Vaticano publicó un documento titulado
Reflexiones sobre la clonación.
• La Iglesia católica sostiene la teoría de que
permitir la clonación humana implicaría una
violación de los principios fundamentales de
los derechos del hombre: la igualdad entre los
seres humanos y la no discriminación.
4. Obtención de genes específicos
Métodos para la obtención de genes

1. Extracción directa del ADN de la célula

2. Aislamiento del ARNm correspondiente al gen

3. Síntesis artificial a partir de la secuencia de

aminoácidos
 DOGMA CENTRAL
DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

expresión de la IG

Transcripción Traducción

Replicación

ADN ARN PROTEÍNAS

Retrotranscripción
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
• La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar
por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la
secuencia en los extremos. La técnica que consiste en replicar una
secuencia de una cadena de DNA hasta infinitas veces.
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
Componenentes: Muestra de ADN
Diseño de los cebadores
DNA Polimerasa
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) dATP, dGTP,
dCTP y dTTP
Tampón de la reacción
5. Recombinación in vitro
1. VECTORES
2. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
3. ADN LIGASA
Molécula de ADN que se utiliza para introducir el gen
en una célula

1. Capaz de replicarse
2. Procedimiento de detección
3. Introducción en una célula
 TIPOS DE VECTORES

1. PLÁSMIDOS BACTERIANOS

2. VIRUS (BACTERIÓFAGOS)

3. CROMOSOMA ARTIFICAL DE LEVADURA

Moléculas circulares de ADN extracromosómico que se
encuentran en muchas bacterias

Contienen genes esenciales para la

supervivencia en determinados medios
(acomodan los genes más pequeños)
PLÁSMIDOS BACTERIANOS
ADN doble hebra, circular

Tamaño 1-200 kb

Replicación autónoma

Beneficio para bacteria hospedadora

(resistencia a antiobióticos)
 Grandes moléculas de ADN construidas con los
centrómeros y telómeros de cromosomas de levadura
y segmentos de ADN extraños

Acomodan genes de gran tamaño

• Insertos de 45 kb

• Vectores Lambda modificados

cos-inserto-cos+ plásmido

• El inserto es ligado por ER y

ADN ligasa

• Empacado en una partícula

Lamba

• Infecta E. coli
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP
 Aisladas a partir de bacterias, las usan como una forma
de sistema molecular para destruir (digerir) el ADN.

 El nombre de cada enz proviene del de la bacteria a

partir de la que se aisla (ej- Sex AI Streptomyces
exfoliata).

 Las enzimas más comunes en biologia molecular son

las que reconocen secuencias de nucleotidos
palindromicas de 4 a 6 pb (ej.- Rco RI

 Cada enzima solo corta en su sitio de reconocimiento

específico.
 Restriction Fragment Length Polimorfismo
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y SUS SITIOS DE ACCIÓN

Extremos
romos

Extremos
cohesivos
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
la «R» en RFLP

 Endonucleasas.

 Exonucleasas.
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Endonucleasas  Las mas usadas en Ing. Genética

Cortan el dsDNA

Región especifica
(sitio de Enzimas de No Cortan
reconocimiento) Restricción su DNA

4,6,8 bases Sensibles a

metilación
Fragmentación del ADN del fago  con EcoRI o BamHI
 MODIFICACIÓN-RESTRICCIÓN

metilasas endonucleasas

SAM
SAH

CH3 CH3 CH3

ADN propio ADN extraño

CH3 CH3 CH3

 SISTEMAS DE MODIFICACIÓN-
RESTRICCIÓN
MECANISMO DE DEFENSA DE LAS BACTERIAS
CONTRA EL ADN INVASOR
Par
endonucleasa R*EcorRV + metilasa
M*EcorRV
de la misma especificidad (reconocen la
misma secuencia)

Protector de modificación (metilación) proteje

su propio ADN

Especificidad de las ER es importante a dos niveles:

1) ER debe cortar la secuencia que contiene el sitio de restricción
y no en secuencias que no lo contienen.
2) ER no deben romper el DNA del huésped
• Cataliza la formación de un enlace
fosfodiéster entre un extremo 3’ OH
y un 5’ PO4
• Une fragmentos de ADN
covalentemente

• No es eficiente con bordes

desafilados

• Usado en ingeniería genética

• Producida por E. coli recombinante

6. Transformación
Transferencia del vector recombinado al interior
de la célula

Infección vírica Transferencia directa

Métodos Químicos Métodos Físicos

•Lipofección •Electroporación
•DEAE-dextrano •Choque térmico
•Cloruro de calcio • Microinyección
• Diferentes cepas por sus genotipos
(DH5α; DH10B, JM109).

• Elegir la cepa adecuada

• Muy transformable

• Si clonamos ADN genómico (se

metila) deben ser MCR-

• Mutación recA (evita la

recombinación homologa)

• endA mutantes (ausentes de

endonucleasas)
• La bacteria mas utilizada en biología
molecular

• Usualmente inofensiva
Excepto E. coli O157:H7 
Diarrea

• Ventajas:
 Crecimiento rápido
 Crecimiento controlado
 Medio mineral con fuente de C
 Crecen en medio líquido, sólido
 Fácil conservación  4 ⁰C, -70 ⁰C
 Aeróbica, anaeróbica facultativa
Inserción de los genes clonados en bacteria – Células
competentes
Transformación

• E. coli competente (tratada

con ClCa choque osmótico)
• Ca en hielo
• Shock térmico
• DNA ingresa
• Se pueden clonar varios genes
• Mismo o diferente vector
7. Selección del gen recombinado
Seleccionar las bacterias transformadas– Colonias
blancas
pU19=método clásico
Cromogénico= ADN=
146 aa de la beta
-galactosidasa LasZ

inductor isopropiltio–β–
D–galactósido (IPTG)
+
IPTG 5–bromo–4–cloro–indolil
–ß–D–galactósido (Xgal)
Seleccionar las bacterias transformadas– Colonias
blancas

+
IPTG
MINI, MIDIS O MAXI PED– ADN plasmidico
• Forma básica en investigaciones en biología molecular

• Métodos para aislar ADN

Pared celular
– ADN bacteriano
Membrana
celular

ADN
genómico
– E. coli
ADN
plasmídico
 Centrifugación
ADN
Extracción química

1era etapa
Lisozima  Pared celular
Ruptura de la SDS  Desnaturalización de
pared celular proteínas
RNAasa  Fragmentación de RNA
Proteinasa K  Digestión de proteínas,
Nucleasas

• Fragmentos de pared celular, moléculas

pequeñas
• ADN
2da etapa
Extracción química fenol-cloroformo

El ADN plasmidico puede llevar genes de resistencia

a antibioticos
2da etapa
pH bajo
EXTRACCIÓN MEDIANTE KIT
evita el uso de fenol

pH alto

SÍLICA
RESINAS
INTERCAMBIO IÓNICO
3da etapa
Precipitación del ADN con alcoholes
Una de las técnicas mas usadas en biología
molecular
ADN  Carga (-)

Separa ADN, ARN

Electroforesis
Purifica ADN, ARN

(+) atrae (-)

• El ADN cargado
negativamente migra
hacia el polo positivo
• La carga neta hace que la
moléculas de ADN migren
independiente de su tamaño
Electroforesis de ADN en gel de agarosa
ADN  Carga (-)

Polisacárido
Agarosa
Extracto de algas
marinas

Tamiz molecular

Filtro para separara las

moléculas de acuerdo a su
tamaño y carga eléctrica
 ELECTROFORESIS EN GEL
Visualización del ADN
Dejar el gel en bromuro de etidio 20 a 30 min ADN  incoloro
500 ug/ml (80 ul en 80 ml de TAE)
ADN, ARN
Bormouro
de etidio Luz UV

Al ser excitado a la luz UV emite una

señal que permite la visualización de
bandas.

Tomar una foto digital al gel de

agarosa expuesto a la luz UV
 •Obtención de proteínas para uso

terapéutico ( Insulina e interferón)

33aa
•Secuenciación del ADN (proyecto

genoma humano)

•Estudio de proteínas poco

abundantes

•Obtención de vacunas de uso

humano y animal
•Vacuna contra la leptospira
•Estreptoquinasa recombinante
•Eritropoyetina recombinante
•Interferón alfa recombinante
•Interferón gamma recombinante
•Factor de crecimiento epidérmico (EGF)
recombinante
•Hormona del crecimiento
•Factor XIII recombinante
•Vacuna recombinante contra la Hepatitis B
•Obtención de nuevas variedades de plantas y animales y
mejoramiento de los suelos

• Terapia génica

•Producción de microorganismos para combatir la

contaminación ambiental.
8. Procedimientos de expresión
 EXPRESIÓN DE GENES CLONADOS

•Vector que contenga un promotor cerca del sitio de inserción

•Rediseño de plásmidos: promotor-operador del operón lac

VECTOR RECOMBINADO

Gen de interés
 INDUCCIÓN ENZIMÁTICA: Operon lac

IPTG Inductor artificial

Allolactose: Inductor
Isopropil β-D-1
natural
tiogalactopiranosido
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
9. Aplicaciones, riesgos y perspectivas de la
Ingeniería genética
SOBREEXPRESIÓN, PURIFICACIÓN Y PRODUCCION
DE ANTICUERPOS POLICLONALES
Purificación por cromaatografia de
afinidad en comumna de recina
sépharose couplée
M PrlR
aux ions
M
nickel et
PrlR
6 His N ter renaturation par dialyses
250 kDa
150 kDa
T7lac prlR 100 kDa

AmpR 75 kDa
50 kDa

37 kDa
Pet15B-prlR Hist 25 kDa PrlR
20kDa
LacI
SDS-PAGE Coloration
bleu de coomassieNitrate d’agent
M Avant Après
kDa Induction Induction

117 Injection de lapin pour la

production d’anticorps
85

48
34
26
PrlR polyclonaux dirigés contre la
19
protéine PrlR
L’anticorps polyclonal anti-PrlR obtenu est très efficace
et spécifique
•Vacuna contra la leptospira
•Estreptoquinasa recombinante
•Eritropoyetina recombinante
•Interferón alfa recombinante
•Interferón gamma recombinante
•Factor de crecimiento epidérmico
(EGF) recombinante
•Hormona del crecimiento
•Factor XIII recombinante
•Vacuna recombinante contra la
Hepatitis B
EL PROYECTO GENOMA HUMANO
Se inició en 1990 previsto para el 2007,
Se terminó el 26 de Junio de 2000, con la
secuenciación de todo el genoma
humano de unos aproximadamente
30,000 genes y 3.3 mil millones de pares
de bases (pb).
 PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• Esta investigación científica tiene como
objetivo conocer el orden en que se disponen
los nucleotidos en la cadena del ADN
humano (determina la secuencia de pares de
bases químicas que componen el ADN) e
identificar y cartografiar (localizar los genes
en cada uno de los 23 cromosomas) los
aproximadamente 30.000 genes del genoma
humano desde un punto de vista físico y
funcional.
 PROYECTO DEL GENOMA
HUMANO
• EL GENOMA HUMANO es la secuencia de ADN de
un ser humano, esta dividido en secuencias que
componen los 23 pares de cromosomas (22 pares
autosómicos y un par de cromosomas sexuales)

• Permite realizar comparaciones de genomas de

otros organismos de secuencias de bases,
organización cromosómica,
• Identificación de genes del genoma y grupos de
genes relacionados en diferentes especies.
• Determinar la secuencia de bases
ORGANIZACIÓN DEL GENOMA
HUMANO
EL GENOMA HUMANO NUCLEAR
• 23 pares de cromosomas

• 3.3 x 109 pares de bases

(3.300.000.000)

• El número total de genes

se estima en 30.000

• 50% del genoma son

secuencias repetitivas

• Eucromatina (secuencias
codificantes)

Cariotipo • Heterocromatina
(secuencias repetitivas)
 PRINCIPALES HALLAZGOS DE LA
SECUENCIACIÓN DEL GENOMA
HUMANO

• Una gran proporción de genes codifican

para factores de transcripción, que regulan la
expresión de otros genes.

• Menos del 2% corresponde a la secuencia

que codifica para las proteínas

• Se desconoce la función de un 50% de los

genes descubiertos
 APLICACIONES
Conocer las bases moleculares de las enfermedades
hereditarias

Enf. De Akzaimer
Células falciformes
 EUGENESIA
El término eugenesia, proviene del griego eu (bien) y
génesis (comienzo), es decir “buen comienzo”, es una rama
de la genética que busca el perfeccionamiento de la especie
humana mediante la intervención científica

Busca e intenta mejorar la dotación genética de las

poblaciones humanas mediante la dirección científica para el
perfeccionamiento del ser humano.
 EUGENESIA
•La técnica de criogenización de semen, óvulos y embriones
(también aplicable a seres humanos adultos) ha hecho
posible los bancos de los mismos.

• Inseminación artificial pueden escoger semen de entre una

gran variedad de donantes cuyas características fenotípicas
pueden dar indicios de la calidad genotípica del semen.

•El punto principal son las potenciales violaciones éticas, y

peligrosos efectos en el uso indebido de las practicas
eugenésicas en seres humanos
 EUGENESIA: ASPECTOS POSITIVOS
• Aspectos positivos
1. Manipulación de genes de ciertas personas con
enfermedades que pueden ser descubiertas en los chequeos
prenatales, eliminando esas enfermedades, y así garantizar
la inclusión social y mejorar la calidad de vida del nuevo
individuo y su familia

2. Se evitaría el sufrimiento físico producido por algunas

enfermedades al eliminarlas, como también se alargaría la
esperanza relativa de vida. (Por ejemplo se investiga acerca
de la DMD –Distrofia Muscular de Duchenne, en la cual se
podría intervenir a nivel embrionario para atenuar los
terribles efectos de la enfermedad
 EUGENESIA: ASPECTOS NEGATIVOS

• Aspectos negativos
•
1. Por mucho que esté avanzada, la ingeniería genética no está
en condiciones de operar con precisión, el ADN inyectado se
integra en el genoma del nuevo organismo en posiciones
casuales, sin posibilidad de prever las interacciones con otros
genes y con la fisiología del organismo.
•
2. La fertilización asistida, podemos sacar aspectos positivos:
generación de una nueva vida, pero también relucen los
aspectos negativos: el resto de los embriones que no son
implantados, se queman o se usan para investigación…. Y si,
tenemos como parámetro que el embrión es vida, estamos
acabando con varias vidas para generar una sola
 EUGENESIA: ASPECTOS NEGATIVOS

• Aspectos negativos

• 3. La eugenesia resulta negativa si es empleada por

satisfacción de gustos personales o preferencias, es decir,
si como padre acudo a la ingeniería genética para
determinar el genotipo y en consecuencia el fenotipo de mi
hijo , por ejemplo : color de ojos, pelo, etc.
 TÉCNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro

de otro previamente amplificada
PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma
simultánea
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
RT-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
 PCR
ELEMENTOS QUIMICOS QUE SE NESECITAN

• DNA molde o templado (ADN o ADNc): contiene la región que

queremos amplificar (si es ADN genómico hablamos de PCR, si es
ADN complementario (ADNc) (ARN mensajero) de RT-PCR(reverse
transcripción-PCR) en esta la reacción es transcripción reversa.

• Enzima: (ADN polimerasa Tag–Termus aquaticus) Catalisis de la

reacción.

• Primers (sec. cortas de Oligonucleotidos) necesarias para que la

ADN polimerasa sintetice ADN (delimitan la sec. Blanco) debenser
complemetarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar

• Desoxiribonucleotidos trifosfato: (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP y

dTTP
• Ión magnesio: cofactor
• Solución amortiguadora o buffer
• Agua
 PCR
ETAPAS
• Desnaturalización

• Hibridación

• Extensiòn

EQUIPO

• Termociclador (diseñado para establecer un

sistema homogeneo de temperatura y tiempo)
Visualización Y Análisis geles de agarosa (bufer TAE o
TBE1X-bromuro de etidio
 APLICACIONES DE LA PCR

• Expresión génica

• Genotipificación

• Detección de patógenos

• Análisis de mutaciones (defectos genéticos)

• Detección de enfermedades hereditarias

• Criminología/medicina forence (identificar personas

a travez de muestras de sangre, cabellos, por
comparacion de ADN)
 Variantes de la PCR
Coloni PCR : Amplificación a partir de una colonia

PCR Nested :Amplificación de una secuencia dentro de

otra previamente amplificada (utiliza otros primers internos
específicos)

PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma

simultánea (varios pares de primers en forma simultanea)
PCR-RFLP :Polimorfismo genético
RT-PCR : Detección de mRNA
Real Time PCR :Cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
 PCR NESTED (ANIDADA)
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers

1 Reacción
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa

2 Reacción
Primers internos
para amplificación SEGUNDA PCR
de una región
especifica
Genera mayor ESPECIFICIDAD
 PCR Multiplex

APLICACIONES
• Amplificación de varias
secuencias de forma Ensayos de deleciones
simultanea Amplifica exones
• Diferentes set de
primers Ensayos forenses
Biomarcadores polimórficos
• Ojo Tamaño del
amplicon
Ensayos microbiológicos
Cepas y especies
RT-PCR RETROTRANSCRIPCIÓN
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
Primers: - Hexameros al azar
- Oligo dT

cDNA

PCR Enzima Taq polimerasa

RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
Síntesis de la 1°hebra de ADN Síntesis de la 1°hebra de ADN
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
RT-PCR Semi-cuantitativa

• Control interno para normalizar: gen

constitutivo (eliminar errores en la
cantidad inicial de muestra)
• PRIMERS: del gen de interés y del
control interno.
• Cuantifica las bandas: relación
gen/control interno
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPSIÓN
PCR ARN  cDNA
RFLP RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM
 POLIMORFISMO ADN
El método de análisis del DNA de grandes genomas, se basa
en el análisis del RFLP (Poliformismo de longitud de los
fragmentos de restricción), tiene una aplicación idónea en la
investigación biológica.
 RFLPs
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM
• METODOLOGIA
• Estudios de 1. Extracción de ADN
polimorfismos:
variación en la 2. PCR – se obtiene la
secuencia de ADN secuencia target

3. Digestión con
enzimas de
restricción 
mecanismo de
defensa de bacterias
 CAMBIOS EN EL SITIO DE RESTRICCIÓN

Person A

5' GGCC GGCC

GGCC GGCC 3'

Person B

5' GGCC GGCC

GGTC GGCC 3'
 CAMBIOS EN EL SITIO DE RESTRICCIÓN

Hae III corta: 5’ GGCC 3’

GGCC GGCC GGCC GGCC 3'

CC GG
CC GG
CC GG

GGCC GGCC GGTC GGCC 3'

CC GG
CC GG
 ADN ADN
ADN NORMAL NORMAL SILVESTRE

A B C

B+
C
A B C
C

ADN MUTADO
B
A A
A B+C
 APLICACIONES

-Pruebas de paternidad

Identificación de personas

Análisis de una escena del crimen

El señor de Sipán
(Lambayeque)

Estudio de restos arqueológicos

Detección del
virus influenza
 POLIMORFISMO ADN
ADN E INVESTIGACIÓN DE LA PATERNIDAD

La mitad del genoma que una persona posee procede del

padre y la otra de la madre, heredándose según los
postulados mendelianos.

, Se utilizan sondas de ADN (fragmentos de DNA) que

contienen secuencias de nucleótidos, complementarias a
secuencias presentes en loci específicos del genoma
humano.
 POLIMORFISMO ADN
IDENTIFICACIÓN DE CADÁVERES

También es posible aplicar la tecnología del

DNA en el campo de la identificación del
cadáver en casos de grandes catástrofes o en
cuerpos que por su avanzado estado de
descomposición no dan resultados concluyentes
con otros métodos más simples.
 POLIMORFISMO ADN
DIAGNÓSTICO PARENTERAL DE
ENFERMEDADES GENÉTICAS

Estudios precoces, utilizando moléculas de

ADN, nos permiten conseguir una fiabilidad
absoluta de un 99,9999 % de probabilidad de
diagnosticar enfermedades genéticas (
hereditarias).
CASO

Se está resolviendo el asesinato del presidente de una

compañía y se han determinado tres sospechosos:

• El jardinero de la casa,
• La esposa del empresario
• El vicepresidente de la compañía.

En la escena del crimen (coche) no se han encontrado huellas

ni en el cadáver ni en el arma homicida, sin embargo se
encontró un mosquito cerca del cadáver que aparentemente lo
había picado antes de su muerte

Se tomaron muestras de ADN de los tres sospechosos, del

cadáver y del mosquito para ser analizadas.
1. Abdomen
mosquito.

2. Ala mosquito.

3. Víctima.

4. Jardinero.

5. Mujer de la
víctima.

6. Vicepresidente.

El asesino…..............
 TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO

Agente intercalante
Bromuro de Etidio
Molécula fluorescente que se
intercala entre la s bases de
la molécula de DNA

Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
 EJEMPLOS DE CORRIDOS DE
ELECTROFORESIS
Con marcador de
Con marcador de 100pb
50pb
 ELECTROFORESIS
REVELADO

Separación de moléculas en un campo eléctrico

Electrodo (+)
Cámara de electroforesis
Camas para preparación del gel
de agarosa

Fuente de poder

Electrodo (-)
 PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR)

 La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la

detección de los productos en un solo tubo.

 “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que

se van generando
 Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en
tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes

UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA) 
Retrotranscripción
 COMPONENTES RT-PCR
Target Segmento de ADN que se ha seleccionado para
amplificar. Es el molde (Muestra).
DNA Polimerasa Enzima capaz de copiar el ADN usado como molde
una hebra simple de ADN (produce una hebra
complementaria).

Primer Segmentos cortos de ADN de cadena simple

específico para un segmento de DNA. Los primers
son usados como punto inicial de la actividad de la
DNA polimerasa.
Nucleótidos Pequeñas unidades de ADN; “letras“ del alfabeto
biológico (A, T, C, G).
Solución Buffer Solución que reúne las condiciones necesarias para
que la reacción de amplificación se de.
Sonda Segmento corto de ADN complementario al target
(marcadores fluorescentes)
Termociclador Equipo que produce ciclos térmicos (Capacidad de
detectar sondas)
 PCR CONVENCIONAL VS. PCR EN TIEMPO REAL

PCR
tradicional
Preparación de la
Amplificación Detección
Muestra

PCR en
Tiempo Real

Preparación de la
Muestra Amplificación y Detección
SECUENCIACIÓN
MEZCLA DE REACCIÓN
 Secuenciación de Sanger

• Reacción de PCR
• Uso de:
– Dideoxinucleotidos
– Deoxinucleotidos  dNTPs
 La Reacción con ddATP
3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTACCATGA

5’TTATCGTA 8pb
11pb
5’TTATCGTACCA 14pb
5’TTATCGTACCATGA 17pb
5’TTATCGTACCATGACTA 19pb
5’TTATCGTACCATGACTAGA 25pb
5’TTATCGTACCATGACTAGAATGCGA
 Separación de Fragmentos
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope

INTERPRETACION
DEL GEL

AGTACTTATGCAGGTC
ACGTGCA
 Secuenciación automatizada
“Dye terminator”
 Marca fluorescente en cada uno de los diferentes nucleótidos:
A, T, G y C.

 Emisión de luz a una longitud de onda especifica  Laser de

iones de argón
Electroforesis
Capilar
LECTURAS AUTOMATIZADAS DE
LAS SECUENCIAS DE ADN

Cromatograma o electrofenograma
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
CITOGENETICA
 Citogenética

Área de la Genética que estudia todo comportamiento celular, basado en el

análisis de la estructura y función de los cromosomas y el núcleo interfásico,
encaminado a establecer sus asociaciones con el desarrollo orgánico, físico y
poblacional de los organismos.

Convencional Molecular
Citogenética convencional
Estructura, alteraciones cromosómicas

46, XY
 Cariotipo
¿Que tipo de alteraciones se pueden estudiar?

• Translocaciones
• Inversiones • Monosomías
• Deleciones • trisomías
• amplificaciones

Estructurales Numéricas
 Estructurales
Translocaciones
1- La tecnología del ADN recombinante es uno de los
hechos más sobresalientes del desarrollo de la
genética molecular.

2- El procedimiento consiste en la obtención de un gen

particular, su incorporación a un vector y su
propagación
3- Los genes pueden obtenerse por aislamiento del ADN,

aislamiento del ARNm o síntesis artificial.

4- Los vectores más empleados son los plásmidos, los

virus y los cromosomas artificiales de levadura.

5- Las aplicaciones de la ingeniería genética son muy

variadas en el campo de la medicina, la agricultura y el
saneamiento ambiental.
6- Los grandes peligros que encierra el uso de esta
tecnología, obliga a implementar y hacer cumplir
regulaciones estrictas que impidan su uso nocivo para
la humanidad.
• 7. Aunque en biología molecular existen muchas técnicas
para detección de cambios tanto a nivel del ADN como a
nivel cromosómico, el secreto esta en seleccionar la mas
adecuada dependiendo de los requerimientos y la
disponibilidad