WESTERN BLOT

FUNDAMENTOS Y GENERALIDADES

Stephania Torres Aguilar

 GENERALIDADES
Detección de una proteína específica en una mezcla compleja.

• Estimar el tamaño de una proteína

• Confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación
• Comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.
 FASES
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

ELECTROFORESIS

TRANSFERENCIA

INMUNODETECCIÓN

REVELADO
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
LISIS
Tampón de lisis con inhibidores: Proteasas: Degradación de Fosfatasas: eliminación de
proteínas grupos fosfatos

LOCALIZACIÓN BUFFER
Célula Entera NP-40 o RIPA
Citoplasmática (soluble) Tris-HCL
Citoplasmática
Tris-Tritón
(citoesqueleto)
Membrana NP-40 o RIPA
Núcleo PIPA
Mitocondria RIPA
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
BUFFER RIPA
IGEPAL •Para solubilizar y aislar proteínas de membrana

ÁCIDO DESOXICÓLICO •Agente detergente, provoca rotura de membranas celulares

SDS •Detergente

ORTOVANADATO • Inhibe la ATPasa, la fosfatasa alcalina y la tirosina fosfatasa.

FLORURO DE FENILMETILSULFONILO •Inhibe serina proteasas tales como quimiotripsina, tripsina, etc.
(PMSF)

ISOPROPANOL •Propiedades desinfectantes

APROTININA •Inhibe Proteasas de Serina

AZIDA SODICA •Inhibe la cadena de transporte de iones

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
DETERMINACIÓN DE LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

• Método Bradford Comassie Blue G-

250; 595 nm

DESNATURALIZAR PROTEÍNAS

• Laemmli:
• TRIS
• GLICEROL
• AZUL DE BROMOFENOL
• Β-MERCAPTOETANOL
• SDS
• Condiciones desnaturalizantes:
• 95 ºC  5 minutos
• 60 ºC  10 minutos
 ELECTROFORESIS
Separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética
PERSULFATO DE
ACRILAMIDA BISACRILAMIDA SDS TRIS TEMED
AMONIO
Uniones con las Mantiene
Moléculas que cadenas de linealidad y Radicales libres
Amortiguador de
polimerizan para acrilamida para uniformidad de Potenciador
formar cadenas formar un carga de las
pH  polimerización
entramado proteínas

Porcentaje Rango Peso Molecular

(kDa)
7,5 25-500
10 15-300
12 10-200
15 10-45
20 5-40
 TRANSFERENCIA
Las proteínas se transfieren a una membrana (soporte sólido) que une e inmoviliza las proteínas
para facilitar su inmunodetección.
■ Requiere membrana de:
– Nitrocelulosa
– Polifluoruro de vinilideno (PVDF).
 INMUNODETECCIÓN
• Leche 0% Grasa
BLOQUEO • Albúmina de suero
bovino (BSA)

• Epítopo  Secuencia
INCUBACIÓN corta de aminoácidos
ANTICUERPO
PRIMARIO • 1 hora a T.A. o toda la
noche a 4ºC

• 1 – 2 horas
INCUBACIÓN
ANTICUERPO
SECUNDARIO
 REVELADO
QUIMIOLUMINISCENCIA FLUORESCENCIA COLORIMETRÍA
 REVELADO

Fig 5. DhL induced the expression of proteins involved in cell cycle arrest and the apoptotic response of D384 cells. D384
cells were exposed to 12.5, 15 and 17.5 μM DhL for 16 h. Total protein lysates were separated by 12–15% SDS-PAGE followed by
western blot analysis with the indicated antibodies against BAX, CDKN1A, TP53, S46-p-TP53, and p139-γH2AX, as shown in
Panel A, and TP73 and Y99-p-TP73, as shown in Panel B. α-Tubulin and ß-actin were used as loading controls for total cell extracts.

TOMADO DE: Bailon-Moscoso N, González-Arévalo G, Velásquez-Rojas G, Malagon O, Vidari G, ZentellaDehesa A, et al. (2015) Phytometabolite Dehydroleucodine Induces Cell
Cycle Arrest, Apoptosis, and DNA Damage in Human Astrocytoma Cells through p73/p53 Regulation. PLoS ONE 10(8): e0136527. doi:10.1371/journal.pone.0136527
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