Recuento de microorganismos viables

Dr. Ricardo J. Anselmo

2018
Leer de la guía práctica:
el tp 3: recuento de
microorganismos viables
 Para entrar en el tema:

Alícuotas o inóculos Cantidad de muestra Equivalente

inoculada

100 g o ml 100 102

10 g o ml 10 101
10 ml de 10-1 1 100
1 ml de 10-1 0.1 10-1
1 ml de 10-2 0.01 10-2
1 ml de 10-3 0.001 10-3
1 ml de 10-4 0.0001 10-4
1 ml de 10-5 0.00001 10-5
1 ml de 10-6 0.000001 10-6
¿Cómo se procede para hacer las diluciones?

Realizar solamente las diluciones suficientes y

necesarias para la obtención de resultados
fidelignos.

Para evitar:
- Riesgo de contaminación
- Gasto de material excesivo
 Diluyentes:
• NaCl al 0,85 %
• Agua peptonada al 0,1 %
• Solución Ringer al ¼
– Volúmenes:
• 90 ml (para el homogenato)
• 99 ml (para el homogenato)
• 225 ml (para el homogenato)
• 450 ml (para el homogenato)
• 9 ml (para diluciones subsiguientes decimales)
• 9,9 ml (para diluciones subsiguientes centecimales)
 Homogenato o primera dilución (1/10)

Una parte por peso en 9 partes de diluyente.

Ej.: Si la muestra pesa 4 g,
4 X 9 = 36
Entonces, sería 4/40
Esto depende de la muestra, en leche cruda basta
con 1 ml en cambio en leche pasteurizada mínimo
10 ml., en leche esterilizada > cantidad

DEBE SER REPRESENTATIVA DE LA MUESTRA O DEL

LOTE ANALIZADO
 Diluciones subsiguientes:
Decimales y/o centecimales en tubos con 9 ó 9.9
ml de diluyente – ó 90 y/o 99 ml dependiendo
de la cantidad de inoculaciones que deberá
efectuar.
 Metodología estándar
Una placa para que sirva para recuento debe
contener de 30 a 300 unidades formadoras de
colonias (u.f.c.) o colonias contadas (c.c.)/g o ml.

¿Por qué u.f.c. o c.c.?

 Límite entre plaqueo y NMP
Muestras líquidas:

10 ml dividido en 5 placas (+ 2 ml en c/u)

2 ml

= 30 colonias/10 ml = 3 colonias/ml
 Límite entre plaqueo y NMP
Muestras sólidas:
10 ml del homogenato o dilución 1/10 (= 1 g )
dividido en 5 placas (+ 2 ml en c/u)

2 ml

= 30 colonias/g
Filtración por membrana de 0,2 µm

Siempre y cuando la muestra sea filtrable por ej.

Agua potable, siendo inadecuado para leche,
aguas superficiales, etc.

Según estándares internacionales: Un rango

aceptable de colonias por filtro de membrana es
de 20 a 200.
Filtración

La membrana de celulosa
retiene a los
microorganismos en su
malla con poros de 0.20-
0.45µm. Esta membrana
se transfiere a un medio
de cultivo para el
desarrollo de colonias.
 Número Más Probable
También llamada técnica de dilución en tubo,
proporciona una estimación estadística de la
densidad microbiana presente en la muestra.
Se basa en que la probabilidad de obtener
tubos con crecimiento positivo disminuye
conforme es menor el volumen de muestra
inoculado.
 Caldo MacConkey
2X 1X 1X
10 ml 1 ml 0,1 ml
de muestra
 Número Más Probable
(< 30 microorganismos/g o < 3 microorganismos/ml)
• Interpretación de la tablas de NMP de la ficha teórica de recuento de
microorganismos viables.

• N° clave: son tres dígitos. El 1° corresponde al último lugar en que todos los
tubos de la serie dieron positivo más los 2 inmediatamente superiores.

Por lo tanto, si la tabla utilizada es de series de 3 tubos, el primer dígito debería

ser un 3.

Si la tabla corresponde a series de 5 tubos, el primer dígito debería ser un 5.

¿Qué harían si se obtiene positividad en todas las series de tubos?

¿Y si se obtienen resultados negativos en todas las series de tubos?

 TABLA NMP DE 3 TUBOS
N° de Tubos Positivos en
Primera serie Serie intermedia Última serie
0 0
0 0
0 0
0 0
0 1
0 1
0 1
0 1
0 2
0 2
0 2
0 2
0 3
Etc. Etc.
3 3
3 3
NMP en el inóculo
de la serie
intermedia de
tubos
0 < 0.03
1 0.03
2 0.06
3 0.09
0 0.03
1 0.061
2 0.092
3 0.12
0 0.062
1 0.093
2 0.12
3 0.16
0 0.094
Etc. Etc.
2 11
3 > 24
Para determinar el NMP/g o ml de muestra se aplica la
siguiente fórmula:
NMP/g o ml = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en
la serie intermedia

Ejemplo:

100 ml de 10 ml de 1 ml de 0,1 ml de
10-1 10-1 10-1 10-1
= 10 g o ml = 1 g o ml = 0,1 g o ml = 0,01 g o ml
3 3 2 0

0. 93 / 0,1 = 9,3 NMP /g o ml

 Ej.: leche fluida
100 ml 10 ml 1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml 10-4 ml
3 3 3 3 3 2 0

NMP/ml = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en

la serie intermedia

0.93 / 0,001 = 930 NMP/ ml

¿Cómo procederían para inocular las últimas tres series de tubos?

 Ej.: suelo agrícola
100 ml 10 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
10 g 1g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g 0,00001 g
3 3 3 3 3 2 0

NMP/g = Valor NMP de la tabla / cantidad de muestra inoculada en la

serie intermedia

0.93 / 0,0001 = 9300 NMP/ g

Número Más Probable de grupos funcionales del suelo por

ejemplo fijadores asimbióticos de Nitrógeno, Nitritadores,
Nitratadores, etc.
Recuentos por las técnicas de siembra en superficie (a) y
siembra en profundidad (b)
0,1 ml
(a)

1 ml

(b)
Alternativas de cálculo de ufc/g o ml:
1. ufc/g o ml = N / vol x dil
donde:
ufc: unidades formadoras de colonias
N: número promedio de colonias obtenidas
para una dilución dada
vol: volumen de inóculo
dil: dilución
2. Dividir N por la cantidad de muestra inoculada,
independiente del método de plaqueo utilizado
es decir superficie o profundidad
 Después de incubar (dependiendo del grupo de
microorganismos a determinar)

• Psicrófilos (a 4°C)
• Mesófilos (a 30 ó 35°C)
• Termófilos (a 55°C)
• Termodúricos (60°C, 30 min)
• Esporas bacterianas aerobias (80°C, 10 min
e incubación aerobia)
• Esporas bacterianas anaerobias (80°C, 10
min e incubación anaerobia)
 Expresión de resultados:

UFC o CC/g o ml = a x 10b

a = varía entre 0,1 a 0,9 o menos de 0,1 si los recuentos

muy bajos lo exigieran

b = 2 ó más de 2

Ej. 0,2 x 104

 Notación científica:

46.700 = 4.67 X 10.000 = 4.7 X 104

4.000.000 = 4.0 X 1.000.000 = 4.0 X 106

253.000 = 2.53 X 100.000 = 2.5 X 105

1.000 = 1.0 X 1.000 = 1.0 X 103

1 = 1.0 X 100
 Resumiendo
• > 30/g o > 3/ml realizo plaqueo.
• = 30/g o = 3/ml plaqueo en 5 placas 2 ml de la
muestra líquida o del homogenato de la
muestra sólida (total = 10 ml de la muestra
líquida ó 1.0 g de la muestra sólida).
• < 30/g o < 3/ml puedo realizar NMP o
filtración por membrana (si lo permite la
muestra, es decir si es filtrable por ej. Agua
potable)
Realizar esquema de diluciones y cuál
o cuáles deberá sembrar para:
a. 1,5 x 106 ufc/g (siembra en superficie)
b. 3,8 x 108 ufc/ml (siembra en profundidad)
c. 8,4 x 105 ufc/g (siembra en superficie)
d. 1,0 x 104 ufc/ml (siembra en profundidad)
e. 2,8 x 107 ufc/g (siembra en superficie)
f. 9,2 x 105 ufc/ml (siembra en profundidad)