Biogenic synthesis of silver nanopar ticles from white rot

fungi: Their characterization and antibacterial studies

INTEGRANTES: JULIANA OSORIO ECHAVARRIA
CURSO BIOTECNOLOGÍA GENERAL. 2018-1
Keywords: White rot fungi, silver nanoparticles, characterization, antibacterial activity
 Aproximadamente el 50% de los
pacientes hospitalizados padecen
Nanopartículas de plata (AgNPs)
anualmente infección por bacterias
resistentes a los medicamentos Las nanopartículas de plata (AgNPs) se definen como
partículas coloidales de plata sólidas con un rango de
tamaño de 1 a 100 nm, que se pueden usar en las áreas de
La producción y el uso indebido de antibióticos ha medicina, catálisis, sensores ópticos y bactericidas
contribuido a la aparición de múltiples organismos
infecciosos resistentes a los medicamentos

Aplicaciones biomédicas
El desarrollo de microorganismos Esto ha resultado en infecciones
resistentes a los antibióticos comunes graves debilitantes e incluso
(debido a sus mecanismos de potencialmente mortales; por lo ⟶Disueltas
tanto, esta situación está impulsando
resistencia) insta a nuevos fármacos la búsqueda de nuevos agentes ⟶Entrampadas
y/o materiales para combatir antibacterianos ⟶Encapsuladas
microorganismos patógenos

Las AgNPs pueden internalizarse Baja probabilidad del desarrollo de resistencia

generando daños por estrés oxidativo,
produciendo acumulación de plata (Ag)
en el interior de la célula.
por parte de los microorganismos.
Los iones de plata causan daño al ADN bacteriano, a enzimas,
proteínas, así como a la pared celular bacteriana. Las nanopartículas de
plata tienen la capacidad de inhibir directamente el crecimiento
bacteriano mediante el intraciclado con la pared celular y dañando
gradualmente las respuestas metabólicas
Nuevo método síntesis: organismos Procesos económicos y sostenibles
eucariotas y procariotas con el medio ambiente

Bacterias, hongos y plantas

Los microorganismos metabolizan los metales como parte de su alimento y poseen un gran
poder enzimático para reducir iones

Proteínas extracelulares Ácidos orgánicos Metabolitos

 Objetivo de la investigación.

En este trabajo, la investigación se centró en la producción,

caracterización y estudios antibacterianos de nanopartículas de plata
(AgNP), utilizando un método de biosíntesis extracelular ecológico
(producción a partir de hongos de pudrición blanca de la madera)
 METODOLOGIA. Sintesis AgNPs
Colecta de cuerpos fructíferos
de hongos (Telangana, India) →
Purificación (Recolección de 55
muestras)
Screening de los hongos para la
• Identificación morfológica
macroscópica
• Identificación molecular
(18S rARN → PCR (ITS1
and ITS4 primers using
BDT v3.1 Cycle
sequencing kit on ABI
3730xl GeneticAnalyzer)
→BLAST (base de datos
NCBI))
Medio de cultivo: glucosa (10 g/L) y
Sobrenadante
extracto de malta (5 g/L), pH: 6, agitación
a 200 rpm y 32°C por 5 días
Solución de AgNO3 (1M)
síntesis de nanopartículas
Incubación a 200
rpm en oscuridad a
32°C
Los cultivos que han mostrado cambios de color
se analizaron para determinar la actividad
antimicrobiana utilizando diversas bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas mediante el
método de difusión de pozos de agar. Control negativo que
solo contiene solución
de AgNO3
RESULTADOS
Un total de 55 cultivos puros fueron obtenidos. Estos se subcultivan y se someten a pruebas de pureza y se
subcultivan cada 3 semanas. Los cultivos puros se mantuvieron en placas e inclinaciones de agar de extracto de
malta. Estos cultivos puros se cribaron para la síntesis de nanopartículas de plata.

Ganoderma enigmaticum
Trametes ljubarskyi
Se observa una reacción positiva para la biosíntesis de AgNPs, debido a que el cambio de color de la solución
donde fue incubado el hongo elucida presencia de AgNPs debido a la excitación de los plasmones superficiales

Se realiza la incubación del sobrenadante con diferentes soluciones de nitrato

de plata (0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 mM), pero se observo que para una
concentración de 1.0 mM y 12 horas de cultivo ya se presentaba un cambio
significativo en el barrido espectrofotométrico y que al aumentar la
concentración no aumentaba la intensidad del pico.

Los extractos de organismos pueden actuar como agentes reductores y protectores en la síntesis AgNPs. Se
especula que la reducción de los iones de plata se da mediante combinaciones de biomoléculas encontradas
en estos extractos, tales como enzimas, proteínas, aminoácidos, polisacáridos y vitaminas. Pero, el mecanismo
es ampliamente aceptado para la síntesis de nanopartículas de plata es presencia de la enzima "Nitrato
reductasa"

Mecanismo Atrapamiento de iones Ag + en la superficie de las células IMPORTANCIA?

fúngicas y la posterior reducción de los iones de plata por las
enzimas presentes en el sistema fúngico
 Reducción vía Nitrato reductasa

Fusarium oxysporum

Nigrospora Oryzae

La reducción de Ag0 se debe a una conjugación

entre el transporte de electrones con la
participación de reductasa, entonces el nitrato
se convierte en nitrito, cada vez que un
electron sea transportado a los iones de plata
entrantes

Mecanismo hipotético de biosíntesis de AgNPs

 METODOLOGIA. Caracterización de las AgNPs obtenidas
Espectrofotometría Uv-vis
Microscopia electrónica de
transmisión (TEM)
Caracterización AgNPs
obtenidas
Espectroscopia de radiación
infrarroja por transformada
de Fourier (FTIR
Actividad antibacteriana
Barrido espectrofotométrico de 350-
470 nm. Para realizar el seguimiento
de la reducción de los iones puros de
plata sintetizados
Para estudiar la morfología superficial
y el tamaño de las nanopartículas,
apoyados del un software de análisis
de imagenes
Medición de los productos
biotransformados presentes durante
el filtrado extracelular
Método Difusión en agar empleando
empleando diferentes patógenos
Gram positivos y Gram negativos
 Estudios de caracterización
Espectrofotometría UV-VIS
La resonancia de plasmones superficiales es utilizado
en bioquímica para el estudio de mecanismos y la
cinética de los enlaces entre los ligandos y los
receptores

Banda de absorción
característica (419 nm)
Barridos espectrofotométricos para la superficie de
correspondientes a 12 horas de plasmon.
incubación
Existe el reporte de varios hongos como F.
oxysporum, P. sanguineus, P. chrysosgenum en
donde la máxima absorbancia se presenta en el
intervalo de 420-430 nm, correspondiente la
banda característica, para diferentes tiempos de
incubación (12, 24, 96 h)
 Estudios de caracterización Vibración de extensión para
aminas aromáticas o
alifáticas (C-N)
Espectroscopia de Infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR)

La interacción entre proteína y AgNP

se analizó mediante FT-IR, con el fin Vibración de
de entender que tipo de flexión de amida
(N-H)
biomoléculas pueden ser las
responsables de la reducción de los
iones de plata y la estabilización de
los AgNP en la solución. Se piensa
Picos de
que las biomoléculas pueden ser los Vibración de vibración
péptidos, proteínas, carbohidratos extensión de C-N
amina primaria
presentes en el extracto libre de (N-H)
células.

Los resultados del presente estudio

evidenciaron claramente que las proteínas
fueron responsables de la estabilización de las
nanopartículas de plata sintetizadas mediante
el filtrado libre de células
Los espectros FT-IR apoyan la presencia de un tipo de proteína compuesto en la superficie de nanopartículas
biológicamente sintetizadas.
Las proteínas pueden unirse a nanopartículas a través de grupos amina libres o residuos de cisteína en las proteínas y
mediante la atracción electrostática de grupos carboxilato cargados negativamente, en las enzimas que se encuentran en
la pared celular de los micelios y por lo tanto , la estabilización de las nanopartículas de plata por proteína es una
posibilidad
 Estudios de caracterización
Microscopia Electrónica de Transmisión

La medición TEM se llevó a cabo para

determinar la morfología y la forma
de los AgNP. Las micrografías de TEM
revelaron que las partículas son
esféricas de forma redondeada y bien
dispersas sin aglomeración en ambos
organismos. El tamaño de partícula
de los AgNP sintetizados por dos
hongos de podredumbre blanca varió
de 15 a 25 nm
El impacto bactericida de las nanopartículas de plata depende del tamaño. La eficacia antimicrobiana de las
nanopartículas depende también de las formas de las nanopartículas, esto puede confirmarse aún más
estudiando la inhibición del crecimiento bacteriano mediante nanopartículas de forma diferencial, debido a
que, las nanopartículas de plata con diferentes formas tienen diferentes efectos sobre las células bacterianas.
Diversos estudios proponen que las AgNPs pueden unirse a la superficie de la membrana celular alterando la
permeabilidad y las funciones de respiración de la célula. Las partículas de tamaño más pequeño tienen una
gran superficie disponible para la interacción, esto daría un efecto bactericida más grande que AgNPs de
mayor tamaño o soluciones de sales de plata.

Se ha probado la eficacia bactericida de las nanopartículas de plata, funcionalizando

diferentes tipos de antibióticos, encontrando resultados prometedores, en donde la
presencia de las nanopartículas aumenta el poder bactericida.
Estudios de caracterización
Actividad antimicrobiana
Por que son importantes las AgNps sintetizadas biológicamente?

Nigella sativa

Estos no deben producir

reacciones adversas al estar en
contacto con tejidos vivos y
fluidos fisiológicos; deben ser,
no tóxicos, químicamente
estables e inertes