MATERIALES Y METODOS

MATERIALES
• Cultivo Kluyveromyces marxianus
• Balanza analítica
• Matraz de 250 mL.
• Vasos precipitados.
• Tubos de ensayo c/t
• Varilla
• Pipetas 10 mL.
• micro pipeta
• Autoclave.
• Mechero bunsen
 Materiales y equipos:
 Fiola de 100 mL.
 Vaso de precipitado de 250 mL
 Varilla.
 Agitador magnético.
 Barra agitadora.
 Rejilla, mechero, trípode.
 Balanza analítica.
 Balanza de platos.
 Agitador de tubos.
 Tubos con tapas (8).
 1 matraz de 1 L, con tapón.
 Espectrofotómetro.
 Micro pipetas
 Determinación de la cinética de
consumo de la fuente de carbono.
 Reactivos:

 5 g/50 mL de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)

 Agua destilada

 3 g de maltosa
 Determinación de la cinética de crecimiento
de biomasa

Reactivos
 Agua destilada
Materiales y equipos
 Tubos de ensayos con tapas.
 Centrifuga.
 Shaker
 Pipetas (estériles)
 espectrofotómetro
 Desecador (campana)
 Capachos de papel aluminio
 Balanza analítica
 Estufa.
 METODOS
A. Diseño del Medio de cultivo (medio mínimo)
 Fuente de carbono: maltosa
 Concentración celular final de 2 g/l
 Volumen del medio es el 20% del volumen del matraz. (Matraz de 1000 ml
y el 20% es 200 ml)
 Ajustar el pH a 6.5 con Ácido ortofostorico o NaOH 2 M y llevar el
autoclave a 121ºC por 15 minutos.
 Tabla Nº 1: Composición del medio de activación químicamente definido
de kluyveromyces para un crecimiento en biomasa de g/0.02L

S0
Elemento Fuente % célula % nutriente Yx/s S0 (g/L) (g/0.0
2L)

C Maltosa 50 42.1 0.506 3.95 0.08

N NH4Cl 9 27.27 3.03 0.99 0.0198
Mg MgSO47H2O 0.4 17.52 43.8 0.068 0.00136

P K2HPO4 2 17.82 8,91 0.337 0.00674

K KCl 0.5 52.38 104.77 0.029 0.0058*

 B. Activación Celular y Desarrollo del inóculo

 Partimos desde la cepa congelada (kluyveromyces marxianus).

 Agregamos la cepa en un tubo de ensayo que contenía 5 ml de
medio rico previamente esterilizado. Ajustar el pH
 Tapamos el tubo con un tapón de gasa y algodón.
 Llevamos al shaker a 200rpm y un t = 12 horas, para
posteriormente sembrar con una o dos azadas en forma
aséptica en un tubo con 16ml de agar inclinado.
 Incubar a 37ºC por 1 a 2 días
 Luego de la incubación, inocular 1 o 2 azadas en un matraz de
125 que contiene 20 ml de medio rico.
 Ahora se realizará el desarrollo del inóculo
 Llevar al shaker para la incubación con una temperatura de 37
ºC con una velocidad de control de 50 rpm. por un tiempo de 4 a
6 hrs. hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente,
evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.
 Después de la incubación inocular los 20 ml de caldo (medio
rico + biomasa) a un matraz de 250 ml. conteniendo 180 ml. de
medio mínimo. A partir de este paso se determinará la cinética
de crecimiento de la biomasa.
 C.- Determinación de la Cinética de
Crecimiento de la Biomasa

 Después de la activación, se inoculara este medio al matraz

de 1 litro, conteniendo 180 ml de medio mínimo. A partir
de este paso se medirá la cinética de crecimiento.
 Sacar 5 ml. del matraz de 1 litro y llevar a
espectrofotómetro, para obtener la biomasa inicial (Xo) a
un tiempo cero.
 Iniciar el medio de fermentación (del cultivo en un medio
mínimo) en el shaker a 37 ºC, 200 rpm. y tomar la
absorbancia por cada hora en un cabo de 12 hrs. en total o
hasta que las medidas de absorbancia evidencien que el
microorganismo haya alcanzado su fase de estacionaria.
 De las absorbancia obtenidas en cada medida podremos
obtener la concentración celular en cada instante,
utilizando la curva de calibración de biomasa que se
encuentra en el Anexo
 D.- Determinación de la Cinética de
Consumo de la fuente de Carbono

 Las muestras utilizadas para medir el crecimiento

de la biomasa, las centrifugamos por 20 minutos a
1000 rpm y guardamos los sobre nadantes en
viales conservándolos en refrigeración.
 Luego las muestra (viales) serán analizadas
mediante el método del DNS como se explica a
continuación.
 Método del DNS (ácido dinitrosalicílico)
 Se precisa realizar los siguientes pasos para el
análisis de la muestra:
 Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de
muestra a analizar.
 Se mantiene la mezcla en baño de agua a
ebullición durante 5 minutos para luego enfriar con
agua helada.
 Se añaden 10 ml de agua destilada, y se deja
reposar por 15 minutos, luego agitar.
 Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua
como blanco.
 La concentración se obtiene interceptando la
medida de absorbancia en la curva de calibrado.
V. RESULTADOS:
 Concentración de la biomasa durante la Fermentación

Tiempo (h) Absorbancia Concentración ln x/x0

(540 nm) (g/l)
0 0.022 0.023 0.000
2 0.052 0.064 1.035
6 0.057 0.071 1.137
8 0.097 0.125 1.711
10 0.083 0.106 1.545
12 0.060 0.075 1.193

Gráfica 01

C onc entrac ió n de B io mas a en la F ermentac ió n

0.140
0.120
0.100
0.080
g r./l

0.060
0.040
0.020
0.000
0 2 4 6 8 10 12
T ie m po (h)
  Gráfica 02

C onc entrac ión de B iomas a en la F ermentac ión

2.000

1.500
lnx/x0

1.000

0.500

0.000
0 2 4 6 8 10 12
T ie m po(h)

Determinación del  máx

:

 máx = (lnx/x0)/(t-t0)

 máx = (ln(0.125/0.071))/(8-6) = 0.2828 h-1

Concentracion de Maltosa durante la Fermentación:
Tiempo (h) Absorbancia (640 Dilución Concentración
nm) (g/l)

0 0.127 20 51.617

2 0.126 20 51.247

8 0.109 20 44.954
10 0.098 20 40.882
12 0.084 20 35.699

Gráfica 03

Concentación de maltosa durante la

fermentación
60
Tiempo (h)

30

0
0 2 4 6 8 10 12
g de maltosa/ l
 Rendimiento de maltosa en biomasa:
Yx/s = X
S

0.125  0.023
Yx/s = - = 0.015
44.954  51.617

PH durante la fermentación:

Tiempo (h) pH
0 3.874
4 3.679
6 3.667
8 3.121
10 3.121
12 3.063
 Gráfica 04

pH durante la Fermentación

3.5
pH
3

2.5

2
0 4 8 12
Tiempo (h)

En el gráfico podemos observar que en estos intervalos el pH

no varia tan considerablemente debido a que el consumo de
sustrato no llega a ser limitado y donde las células van teniendo
un crecimiento de latencia; al llegar a las 10 horas de la
experiencia se tuvo un pH de 3.121 notándose entonces que la
actividad del kluyveromyces marxianus aumenta; en la fase
logaritmica tenemos un cambio brusco en el pH
 DISCUSIONES
Datos teóricos:

DETERMINACIÓN DEL m:

µM = 0.3838 h-1

Determinación del tiempo de fermentación teórico.

Calculo del tiempo de cinética

t= ln(xf/xo)(1/µM)

Con los datos de la práctica:

t= ln(2/0.2)(1/0.3838)
t= 6h
RENDIMIENTO:
YX/S = X / - S
Yx/s = (42.1/50)x0.6 = 0.505
 CONCLUSIONES
 El diseño de los diferentes medios tanto activación como
fermentación tiene que tener la adecuada cantidad de fuente
de N (NH4Cl), fuente de carbono (Maltosa), vitaminas (extracto
de levadura) y otros (las demás sales usadas) para poder
desarrollarse, como además de los adecuados gases que este
caso fue el aire que proporcionó oxígeno al cultivo de
Kluyveromyces marxianus.

 El rendimiento de biomasa en sustrato del Kluyveromyces

marxianus fue de 0.015 para las condiciones de medio
limitante, teniendo como fuente de carbono la maltosa y con
parámetros de fermentación de 30 °C , pH 3,5 (tampon citrato-
fosfato) y velocidad de agitación de 200 rpm. Por lo que
deducimos que el diseño de medio no brindo las condiciones
adecuadas para que el microorganismos puede reproducirse o
que el microorganismos no tiene aptitud reproductora sino de
productora de inulinasa más bien .
 El microorganismos Kluyveromyces marxianus si
influye en el cambió de pH del medio a pesar de
llevar tampón haciendolo descender es decir es
un microorganismo productor de protones el cual
los produce a partir de la fuente de N (NH4Cl).

 Se pudo identificar en el microorganismo

Kluyveromyces marxianus la fase de latencia, la
fase logaritmica y una muy ligera fase estacionaria
además que se pudo reconocer que el
microorganismo presenta la característica de
también presentar una fase de decadencia sin
recuperación.