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Tema: 3

CRECIMIENTO MICROBIANO
INTRODUCCION
• Crecimiento.-Multiplicación de los
microorganismos cuando se encuentran en un
medio adecuado
• Nutrición.-Ciencia que estudia los procesos
alimenticios en los seres vivos.
• Nutrientes.- Compuestos que proporcionan
energía y material para biosíntesis.
CURVA DE CRECIMIENTO
• Curva de crecimiento, historia del desarrollo.-
Fases o etapas por las cuales pasan los
microorganismos en el transcurso de sus
vidas. Estas se dividen en: a) Fase de latencia o
retardo b) Fase Logaritmica o exponencial
c)Fase estacionaria d) Fase de muerte
CURVA DE CRECIMIENTO
FASE DE RETARDO
• Periodo de adaptación al nuevo medio,
empieza ni bien se inocula.
• No existe multiplicación.
• Duración: Variable en función de: Edad de
inóculo, Tamaño de inóculo (3-10% Vf),
condiciones nutricionales y fisicoquímicas.
• dx/dt=0
FASE EXPONENCIAL
• Se inicia la reproducción.
• Velocidad de crecimiento constante.
• Se detiene por: Agotamiento de nutrientes,
Acumulación de productos tóxicos,
características propias de los micoorganismos.
(Bact:109 cel/ml y protozoos 106 cel ml)
• dx/dt= x
RELACIÓN CURVA DE
CRECIMIENTO VS SUSTRATO
RELACIÓN CURVA DE
CRECIMIENTO VS SUSTRATO
FASE ESTACIONARIA
• Se detiene el crecimiento
• Los microorganismos se mantienen viables
solo algún tiempo.
• Posteriormente entran en la siguiente fase.
• dx/dt=0
FASE DE MUERTE
• En esta etapa los microorganismos viables
empiezan a morir
• Se da generalmente por el agotamiento de
nutrientes.
• Suele darse en esta etapa la Fagocitosis.
• Se da en forma logarítmica
• dx/dt=-kdx
EXPRESION MATEMATICA DEL
CRECIMIENTO
Es importante una modelación para:

A) Investigación básica fisiológica y ecológica.

B) Solución de problemas industriales.


TIEMPO DE GENERACION O
DUPLICACIÓN
• Tiempo requerido para que una población
duplique su cantidad (td)
• Característico de cada especie
• Variable en función: Características
nutricionales y fisicoquímicas.
Si: Xo--2Xo--4Xo--8Xo-------nXo (1)
td1 = td2 = td3 = td4= td
TIEMPOS DE GENERACIÓN
BACTERIA MEDIO tg=td (min)
E. coli Glucosa- sales 17
Bacillu megaterium Sacarosa-sales 25
Streptococos lactis Leche 26
Sataphylococos aureus Infusión de corazón 27-30
Streptococos lactis Medio con lactosa 48
Lactobacilus acidophilus Leche 66-87
Rizobium japonicum Manitol-sales-Ex.levadura 344-461

Mycobacteirum tuber. Medio definido 762-932


Treponema palllidum Testículos de conejo 1980
NUMERO DE GENERACIONES
• Es el número de veces que una población se
ha multiplicado (n)
n=t/td (2)
donde:
t= Tiempo total del cultivo
td= Tiempo de generación o multiplicación.
DENSIDAD CELULAR
• La ecuación (1) puede ser representada por:
X=Xo* 2n= Xo*2 t/td (3)
Con (3) puede calcularse la densidad celular
Aplicando logarítmos a la ecuación (3)
ln X= ln Xo + t/td ln 2 (4)
Despejando t/td = n tenemos:
n= (ln X - ln Xo)/ ln 2 (5)
VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
• Acomodando la ec.(4) tenemos:
1/t ln(X/Xo) = ln 2/td (6)
Derivando el primer miembro de (6) respecto a
X tendremos:
1/X * dx/dt = 0.693/td (7)
La ec. (7) es la ecuación diferencial del
crecimiento
ECUACIÓN DE MONOD
• Es una ecuación empírica que describe el
crecimiento microbiano:
dX/dt = μ X (8)
Donde: μ = Velocidad específica de crecimiento
(=) t-1
X= Concentración de microorganismos (=) g/lt
ECUACION DE MONOD

• Si comparamos la ecuación (7) y (8)vemos


que:
μ= 0.693/td (9)
CRECIMIENTO CON LIMITACION DE
SUSTRATO
• A medida que el cultivo se multiplica, los
nutrientes disminuyen.
μ = μmax S/ (Ks +S) (10)
Donde:
μmax= Velocidad específica máxima de
crecimiento (=) t-1
S= Concentración de sustrato (=) g/lt
Ks= Constante de saturación (=) g/lt
Concentración de sustrato vs
velocidad de reacción
FACTOR DE RENDIMIENTO
• Es un valor que representa la cantidad de
producto formado por cantidad de sustrato
consumido. (Y)
dx/dt= -Y dS/dt (11)
Y = dx/dt /- ds/dt
Y=- DX/DS = (Xf-Xo)/(So-Sf) (12)
Donde: DX= Incremento de biomasa
DS= Decenso de nutrientes
VELOCIDAD DE CONSUMO DE
SUSTRATO
• Es la velocidad a la cual se va agotando el
sustrato de un medio de cultivo.
Despejando de (11) tenemos:
dS/dt = -1/Y dx/dt (13)
Reemplazando (8) y (10) en (13) tenemos:
dS/dt=-1/Y μmax S/(Ks+S) * x (14)
dS/dt= - KSx/(Ks+S) (15)
VELOCIDAD DE CONSUMO DE
SUSTRATO
• Donde:
K= Velocidad de consumo de sustrato =μmax/Y (=)
t-1
Nota.- En tratamientos biológicos la distribución
de edades es amplia y por tanto la tasa de
crecimiento debe corregirse.
VELOCIDAD DE CONSUMO DE
SUSTRATO
EJEMPLO
µ = 0,5h-1 t(h) X

dx/dt= µx 0 200,0

Xo = 200 2 543,7

4 1477,8

6 4017,1

8 10919,6

10 29682,6

12 80685,8

14 219326,6

16 596191,6

18 1620616,8

20 4405293,2
METODOS DIRECTOS DE CONTEO DE
COLONIAS
CAMARA PETROFF- HAUSSEN
Se puede utilizar diversos tipos de cámara. En
general se conoce el volumen exacto del liquido
que queda atrapado en el lugar donde se realiza
el recuento, que se cuenta un numero variable
de estos cuadrados y se extrapola la media al
numero de microorganismo por mililitro.
CAMARA PETROFF- HAUSSEN
VENTAJAS:
• Rápido y poco material implicado.
• Cuando se cuenta por cuadrados evitamos
confundirnos.
DESVENTAJAS:
• Poco sensible, se requiere una concentración
• de 107 cel/ml, o más para que se pueda observar
una célula en el campo microscópico.
• No puede medir bacterias móviles
• No distingue las células vivas de las muertas.
• Es impreciso
CAMARA PETROFF- HAUSSEN
CAMARA PETROFF- HAUSSEN
Pasos a seguir:
• En este método la suspensión de la muestra se
coloca en la cavidad cuadriculada de
dimensiones conocidas de la cámara, y se tapa
con el cubre objetos.
• Como se conoce el área de las cuadrículas y la
altura de la cámara de recuento, el volumen
ocupado por la suspensión en cada
cuadrículas queda determinado.
CAMARA PETROFF- HAUSSEN
Por tanto, para obtener el número de bacterias
por mililitro de suspensión, todo lo que se
requiere es contar el número de
microorganismos en varias cuadriculas,
calcular el promedio de recuento por
cuadrícula y multiplicar este promedio por el
factor correspondiente.
RECUENTO EN PLACA
Consiste en un plaqueo de un volumen conocido
procedente de la muestra que se analiza. El
resultado es función de una serie de factores
(como son el método de muestreo) y los cultivos
pueden hacerse tanto en superficie , como en
profundidad.
RECUENTO EN PLACA
los pasos a seguir son :
• Estima el numero de células viables
• Se emplea placas Petri que contengan el
medio de cultivo idóneo para el crecimiento
microbiano.
• Se siembra un volumen conocido de muestra.
• Se procede a contar el numero de colonias.
RECUENTO EN PLACA
• Si la cantidad de bacterias es elevada se
preparan diluciones.
• Se siembra un determinado volumen en la
placa Petri, para luego calcular el numero de
bacterias por mililitro (expresado como UFC).
RECUENTO EN PLACA
VENTAJA:
• Su gran sensibilidad
• Si se usa un medio y unas condiciones de
incubación adecuadas, puede detectarse incluso
una única célula viva.
• El recuento en placa no requiere un esquipo
complicado.
RECUENTO EN PLACA
DESVENTAJAS:
• No mide el numero total de células sino
únicamente las viables.
• Un inconveniente es que el recuento en placa
es lento y tedioso y no es preciso, porque las
precisión depende del recuento de un numero
elevado de colonia.
RECUENTO EN PLACA
RECUENTO EN PLACA
a) Método de extensión en placa (o en
superficie):
0,1 ml de la suspensión celular se extiende
sobre la superficie de la placa usando una
espátula de Drigalski. La placa se incuba y se
cuentan las colonias.
b) Método de vertido en placa (en volumen).
1 ml de la suspensión en la placa y se agrega el
agar fundido a 45 ºC.
RECUENTO EN PLACA
MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA
Utilizado cuando el numero de bacterias es bajo,
son filtros con un por de 0,45um que retiene las
bacterias, se filtra un volumen dado y se coloca
el filtro sobre una placa de medio de cultivo
apropiado, donde crecerán tantas colonias como
bacterias hayan quedado adheridas al filtro.
MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA
Cuando las concentración es baja y el volumen
de la muestra es grande .
La muestra se hace pasar por un filtro cuyo poro
retenga a la bacteria, estas son transferidas a un
medio de cultivo donde serán contadas las
colonias.
MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA
VENTAJAS:
Nos permite poder separar las bacterias del
medio acuoso.
DESVENTAJAS:
Hay la posibilidad de que no todas las bacterias
se queden en el filtro.
MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA
DILUCIONES SERIADAS
Es un método estadístico basado en series de
diluciones y calculo estadístico de numero de
bacterias presentes en la diluciones mas altas.
• Cuando mayor es la dilución necesaria.
• Reducir a 0 el numero de bacterias en una
muestra.
• Mayor será el numero de bacterias en la
misma.
DILUCIONES SERIADAS
VENTAJAS:
• Técnica fácil , idea general de la población
bacteriana.
• También se usa para determinar el numero de
células de un cultivo mixto que pueden crecer
en un medio liquido.
• Proporciona un 95% de posibilidades de que la
población bacteriana este dentro determinado
margen.
DILUCIONES SERIADAS
DESVENTAJAS:
• Método popular pero poco exacto.
DILUCIONES SERIADAS
DILUCIONES SERIADAS

• Pasos a seguir:
• Se toma 1 mL de la muestra, la cual puede ser
un cultivo de bacterias o cualquier otra
muestra que contenga bacterias en
suspensión.
• Se añade a un frasco de dilución que contiene
99 mL del diluente adecuado, se agita y se
toma de esta primera dilución (1:100 ó 10-2) 1
mL .
DILUCIONES SERIADAS
• Se transfiere a un segundo frasco de dilución
que contiene 99 mL del diluente adecuado, se
agita y se toma de esta segunda dilución
(1:10.000 ó 10-4) 1 mL
• Se transfiere a un tercer frasco de dilución que
contiene 99 mL del diluente adecuado (esa
corresponde a la dilución 1:1.000.000 ó 10-6).
• De cada se siembran por triplicado muestras
de 1 mL y se incuban en posición invertida por
24 horas o más y se cuentan las colonias.
METODOS PARA MEDIR EL
CRECIENTO MICROBIANO
METODOS INDIRECTOS
NEFELOMETRIA
Es un procedimiento analítico que se basa en
la dispersión de la radiación que atraviesan las
partículas de materia y consideran 3 factores:
• La concentración
• Tamaño de la partícula
• Longitud de onda
ESQUEMA DE FUNCIONAMIENTO

Longitud de onda
Bacterias 540 nm
Protozoarios 580 nm
Levaduras 600 nm
TURBIDEZ
• Los patrones de Mc Farland se utilizan como
patrones de turbidez en la preparación de
suspensiones de microorganismos. El patrón
0,5 de Mc Farland tiene una aplicación
• El objetivo de este procedimiento es
determinar el número de bacterias por ml de
fluido
PRINCIPIO DE FUNCIONAMIENTO
• Las normas de turbidez se preparan
mezclando productos químicos que generan la
precipitación para formar una solución de
turbidez reproducible.
• Para una cantidad de 100 ml de agua
purificada
• Acido sulfúrico 0,18 M = 99,5 ml
• Cloruro de bario 0,048 M = 0,5 ml
ESQUEMA DE FUNCIONAMIENTO
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Comparar la turbidez de la muestra con
bacterias y el tubo de Mc Forland contra un
fondo de barras negras y blancas.
En cuanto a la distorsión de la barra negra
indica una turbidez similar en los tubos. MDM
CIENTIFICA S.A.S.
DETERMINACIÓN DE PESO
SECO/CANTIDAD DE PROTEÍNA
Esta técnica tiene relación a la concentración
celular bacteriana expresada en unidades de
peso seco (µg/ml-mg/ml), es útil para grandes
volúmenes.
DETERMINACIÓN DE PESO
SECO/CANTIDAD DE PROTEÍNA
La curva patrón para la determinación de
proteínas por el método de Lowry. Es un
método calorimétrico de valoración
cuantitativa de las proteínas, consiste en
colocar a la muestra un reactivo que forme un
complejo coloreado con las proteínas.(Randal
J.1951)
CLASIFICACION DE MEDIOS DE
CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o
una solución de nutrientes que
permite el desarrollo de
microorganismos. (Saravia K. 2008)
SEGÚN SU ORIGEN
• Naturales: son los preparados a partir de
sustancias naturales de origen animal o vegetal
cuya composición química no se conoce
exactamente.
• Sintéticos: son los medios que contienen una
composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.
• Semi-sinteticos: se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto
orgánico complejo.
SEGÚN SU CONSISTENCIA

• Líquidos: se denominan caldos y contienen los


nutrientes en la solución solida.
• Sólidos: se prepara añadiendo un agar a un
medio liquido (caldo).
• Semisólidos: contienen 7,5 g de agar/litro de
caldo. Se utilizan para determinar la motilidad
de las especies de estudio.
SEGÚN SU COMPOSICION
• Comunes o universales: crecimiento . Es el
medio más frecuentemente utilizado para
mantener colonias microbianas.
• Enriquecidos: están compuestos de un medio
base como apoyo del crecimiento al cual se les
puede agregar un gran exceso de nutrientes
como suplementos nutritivos. Se utiliza para
microorganismos que tienen grandes
exigencias nutricionales.
• Selectivos: son sólidos en los que la
selectividad se consigue alterando las
condiciones físicas del medio con el fin de
inhibir el crecimiento de especies químicas
cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de
medio solo permite el crecimiento de un
grupo de microorganismos e inhibiendo el de
otros. Se utiliza para seleccionar e aislar
microorganismos a partir de poblaciones
mixtas.
BIBLIOGRAFÍA
• Universidad privada Antenor Orrego Facultad
de medicina/Ciencias Cátedra de
microbiología. Dr. José Gonzales Cabeza
• Análisis Microbiológico De Los Alimentos
Metodología Analítica Oficial
“Microorganismos Indicadores” Noviembre
2014
• Saravia K., Garces A. Cultivo de los
microorganismos.2008.