TECNOLOGIA DE DNA

RECOMBINANTE

 TRANSGENES
 ORGANISMOS
GENETICAMENTE
MODIFICADOS
(OGM)
 CLONAJE DE
GENES
 Clonación de genes

Una clona es definida como un gran numero de células o moléculas

todas idénticas provenientes de un origen único

Clonación del DNA ha sido posible por:

Enzimas de restricción.

La capacidad de los vectores de clonación de multiplicarse después

que DNA ha sido insertado en su genoma.
 Clonación del DNA
Es la inserción de DNA en un vector de clonación y
luego este vector con el DNA debe ser introducido en
bacterias o levaduras u otra célula hospedera.

QUE SE PUEDE CLONAR

1. Un gen o una secuencia

2. Todo el genoma de una célula: Librería genomica.
3. Todo lo que se transcribe de una célula (transcriptoma):
Librería de cDNA
 PARA QUE SE CLONA DNA?

1. Conocer la secuencia

2. Expresar una proteína

3. Para conocer secuencias regulatorias

4. Conocer secuencia de microorganismos de difícil

cultivo o no cultivables.
etapas:
1. Obtención del “gen inserto” o producción de fragmentos
de DNA, entre los cuales se encuentra el que contiene el
gen de interés.
2. Fragmentación del DNA mediante enzimas de restricción
3. Elección del vector de clonación: plasmados, fagos,
cosmidos, fagemidos, BACs, YACs
4. Unión del gen inserto al DNA del vector de clonación. La
molécula resultante de la combinación del DNA a
transportar y el DNA vector se denomina DNA
recombinante.
5. Introducción del DNAr a la célula hospedera o
Transformación de células hospederas por los vectores y
transferencia del fragmento de DNA. Se dice que dichas
células han sufrido transformación.
6. Selección e Identificación de aquellas células que
efectivamente han recibido el fragmento de DNA con el
gen de interés.
 Esquema general de clonación de una secuencia o DNA

Vector DNA a clonar

Célula hospedera Selección de clonas

Tranformación
1.Obtencion del gen
inserto o gen de interés
 A partir del organismo que lo
contiene.
 Por sintesis de cDNA
(retrotranscripcion)
 A partir de una genoteca o libreria
genomica
 Genes o DNA sintetico
• A partir del organismo que lo
contiene:
 Elusión de cada fragmento
 Secuenciación de cada fragmento
 Comparación de secuencias con una
Base de Datos.
 Recuperación del Gen de Interés o
Gen Inserto
 SECUENCIACIÓN DEL DNA
- Secuenciador automático (detección por fluorescencia)
- Usa 4 ddNTPs unidos a una molécula fluorescente (de diferente color para cada uno)
- Una única reacción
- Lectura: electroforesis en gel capilar, láser + detector fluorescencia (automatizado)


Secuencia
Secuencia
Base de Datos
 POR SINTESIS DE cDNA (retrotranscrpcion)
 Obtencion del Gen Inserto a partir de
una Genoteca o Libreria Genomica

–Genotecas de DNA
genomico

–Genotecas de cDNA
 LIBRARY

TEJIDO VECTORES

mRNA DNA

cDNA DNA digerido

(doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR
DNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARY
cDNA o genómica
Screening y subclonado
Seleccion de un clon a partir de una
genoteca (Hibridacion in situ)
 A PARTIR DE DNA SINTÉTICO
Los oligonucleótidos [del Griego oligo, poco o escaso]
son cortos segmentos de DNA con una longitud de 2 a 30
nucleótidos. La capacidad de sintetizar oligonucleótidos
de DNA de secuencia conocida resulta
extraordinariamente útil. Por ejemplo, pueden
sintetizarse secuencias de DNA cortas y prepararse
fragmentos de DNA de mayor longitud para ser utilizados
en diversas técnicas moleculares.
 Secuencia DNA sintético
2.- ENZIMAS DE
RESTRICCION
Sistemas de modificación-restricción
M-R
 Enzimas de restricción
 Descubiertas en 1970s.
– Reconocen + 3000 secuencias de nucleótidos
diferentes
– Aisladas de mas de 100 especies bacterianas
diferentes

 Endo- : Rompimiento de enlaces

 Exo- : Digestión desde los extremos

Enzimas que cortan ds DNA en secuencias especificas.

a. Papel natural
Usadas para proteger las bacterias
de virus (Cortando DNA Viral)

DNA Bacteriano es protegido por enzimas que

Modifican el DNA
TIPOS ENZIMAS DE RESTRICCION

 Enzimas de restricción tipo I

– 3 sub unidades: Corte, metilación y
reconocimiento asimétrico
– Cofactores: Mg+2, ATP, AdoMet
– Cortan aleatoriamente en sitios lejanos al sitio de
reconocimiento
 Enzimas de restricción tipo III
– 2 sub unidades : Corte y reconocimiento
asimétrico, metilación
– Cofactores: Mg+2, ATP
– Corta en sitio fijos cerca del sitio de
reconocimiento
 Enzimas de restricción tipo II
– Sub unidades únicas, enzimas
para modificación y restricción
separadas, dos genes
estructurales.
– Corte en sitios fijos con sitios de
reconocimiento simétricos
– Cofactores: Mg+2
 Nomenclatura

1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli
(Eco); Haemophilus influenzae (Hin) )

2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )

3º. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de
esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.

4º. Todas deberían llevar delante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la
enzima, pero generalmente se omite.

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

Género de la
E Escherichia
bacteria
Especie de la
co coli
bacteria
Cepa de la
R RY13
bacteria
Orden de
La primera
identificación de
I enzima
la enzima en la
identificada
bacteria
CARACTERITICAS: E.R.
PATRONES DE CORTES QUE GENERAN ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Extremos 5' cohesivos: La enzima corta asimetricamente, resultando una

cadena sencilla que se extiende en los extremos 5´.

Ej. Bam HI.

Extremos 3' cohesivos: La enzima corta asimetricamente, esultando una

cadena sencilla que se extiende en los extremos 3´.

Ej. Kpn I.

Extremos romos: Enzimas que cortan precisamente en sitios opuestaos en

las dos cadenasgenerando extremos romos sin protusion.

Ej. Sma I
 Presencia de secuencias
isoesquizomeros
 Una misma secuencia de DNA puede ser
reconocida por mas de una enzima de
restriccion= isoesquizomero
Un patrón de ADN generado mediante electroforesis que se produce después de
cortar con una enzima de restricción.
 Mapeo con enzimas de
restricción
• Un mapa de restricción es una descripción de los sitios de
corte de una ER en un fragmento de DNA
– Caracterizar un DNA desconocido

– Prerrequisito para su posterior manipulación

• Como se puede hacer un mapa de restricción?

– Digestión de DNA con varias enzimas de restricción

– Digestión parcial de un DNA marcada en un extremo.

Mapeo con enzimas de restricción
 MAPAS DE RESTRICCION

 Calculo Teórico de Frecuencia de corte

 Si los sitios de restricción fueran distribuidos

al azar en la longitud de una molécula de
ADN, una enzima que reconocería una
secuencia de 4 nucleótidos, cortaría 1/256
nucleótidos, mientras que una enzima que
reconocería 6 nucleótidos cortaría en
promedio 1/4.096 nucleótidos.
Fragmentos de restricción

- Frecuencia de corte de aproximadamente 1/4N

(N numero de bases en el sitio)

- Los fragmento se separan mediante

electroforesis

- Cortes ordenados generan un mapa de

restricción

Frequencia de corte

• 4-base cutter 44 = 256 bp

• 5-base cutter 45 = 1,024 bp

• 6-base cutter 46 = 4,096 bp

• 8-base cutter 48 = 65,536 bp

 Enzima que corta en secuencias de 4 nt:

Corta el DNA en fragmentos de 256 bp en una secuencia al azar

Mapeo con enzimas de restricción
Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por separado con dos
endonucleasas de restricción y luego con una mezcla de ambas
obteniéndose los fragmentos indicados a continuación :

– ER Fragmentos (Kb)
– EcoRI 3.0 y 4.0
– HaeIII 2.0 y 5.0
– EcoRI + HaeIII 2.0 , 1.0 y 4.0
3.-VECTORES DE CLONACIÓN

Tipos de vectores:
 plásmidos,
 bacteriófagos y otros virus,
 cósmidos
 fagemidos y
 cromosomas artificiales BACs, YACs.
 Tipos de vectores
Vector Cel. huesped Tamaño inserto

Plasmids Bacteria Hasta 15 kb

Fago lambda
Bacteria Hasta 25 kb
BAC (bacterial
artificial Bacteria 100-500 kb
chromosome)
YAC (yeast
artificial Yeast 250-1000 kb
chromosome)

Cosmid Bacteria 30-45 kb

 CARACTERISTICAS:
 Debe replicarse independientemente o
tener replicación autónoma
 Debe contener algunos sitios de corte
único para enzimas de restricción.
 Debe poseer algún marcador de selección,
generalmente genes de resistencia a
antibióticos o genes de enzimas que la
célula huésped no tenga, para poder
reconocer las células transformadas de las
no transformadas.
 Debe ser de fácil manipulación e inocuo
para el manipulador.
PLASMIDOS
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que existen en
bacterias y en el núcleo de algunas células eucarióticas. Se pueden
replicar independientemente de la célula hospedera. El tamaño de un
plasmido oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
Propiedades deseables de un plasmido:

 Debería ser pequeño.

 Secuencia debería ser conocida.

 Alto numero de copias. Origen de

replicación

 Debe contener un marcador de

selección.

 Debería contener un segundo

marcador de selección que se inactive
por la inserción del DNA clonado.

 Tener un gran numero de sitios únicos

para ER en uno de los dos marcadores
de selección.
 Caracteristicas del plasmido pBR 322:

 es relativamente pequeño : 4361 pb

 estabilidad en el huésped (E. coli) alto numero de copias : 20
– 30 por célula
 puede ser amplificado en un alto numero – 1000-3000 copias
por célula
 es fácil de separar en forma súper enrollada
 una cantidad razonable de DNA foráneo puede ser insertado
(mas de 10 kb es inestable)
 la secuencia de bases completa de este plasmido es conocida,
haciendo posible localizar los sitios donde actúan las E.R.
 hay un solo sitio de ruptura para varias enzimas de restricción
tiene dos marcadores de resistencia a antibióticos: ampicilina y
tetraciclina
 puede ser colocado en células fácilmente por transformación
pBR322
Clonación en plásmidos
Fagos:
Son virus que infectan bacterias. La principal ventaja de estos vectores es
su alta eficiencia de transformación, alrededor de 1000 veces mas que un
vector tipo plásmido.
 LAMBDA tiene un complejo mapa genético y
un gran numero de genes, sin embargo el
tercio central del genoma no es esencial y puede
ser sustituido con DNA foráneo.
 Existen Fagos Lambda modificados: Charon fagos,
donde algunos sitios de restricción han sido
removidos: existen variantes con un solo sitio de
restricción y en estas el DNA foráneo puede ser
insertado.
 Mientras aquellos variantes que poseen dos sitios
de restricción el DNA foráneo puede reemplazar
el DNA lambda, y estos son conocidos como
vectores de reemplazo
Fagos vectores: FAGO
LAMBDA
•Mapa genético linearizado del Fago Lambda

Extremos COS (12 nucleótidos responsables del

empaquetamiento
Clonación en Fago Lambda
Cosmidos

Son una combinación de un plasmido y los sitios cos, lo cual permite

empaquetar este DNA en la cabeza de un virion y luego ser introducido
en bacterias facilmente.
 El cósmido pJB8 contiene
 un origen de replicación bacteriano
(ori), un solo sitio cos,
 un gen de resistencia a ampicilina
(ampR, para seleccionar las colonias
que han incorporado el cósmido), y
 una región que contiene cuatro sitios
de restricción para la clonación (
BamHI, EcoRI, ClaI y Hindlll).
 Puesto que el vector es pequeño
(5,4kb de longitud), puede aceptar
segmentos de DNA exógeno de 33 a
46kb de longitud.
 El sitio cos permite que el cósmido
que contenga un inserto grande se
empaquete con proteínas de cubierta
vírica de lambda como si fuesen
cromosomas víricos.
CÓSMIDOS VECTORES
Procedimiento para clonar DNA en cosmidos
 Vectores de expression
 El plásmido pUC19, un vector de clonación de
nueva generación de plásmidos utiliza genes
reporteros como lac Z, para delatar la presencia de
un plásmido con el inserto.

 En el plásmido, este gen, que es responsable por la

producción de ß-galactosidasa, se encuentra
interrumpido por un sitio de clonación múltiple
(polylinker). En presencia de sustrato (X-gal) y un
inductor (IPTG), lac Z da lugar a una colonia de
color azul, pero cuando el plásmido ha recibido el
inserto en el sitio de clonación múltiple, lac Z es
interrumpido, el péptido no se forma y las colonias
son blancas.
 Fagemidos

 Son vectores que combinan las características de

un fago filamentoso (M13) y un plásmido
(pBR322) y contienen tanto el origen de
replicación del fago como del plásmido.
 El fagemido Bluescript II

 Esta formado por DNA duplex ciclico de 2961 pb

comprende:
 un fragmento lac Z, el polilinker y 2 promotores:
 El fragmento Lac Z codifica el peptido α y permite
la α-complementacion.
 El polilinker contiene 21 sitios de restricción.
 Los 2 promotores T7 y T4 que flanquean el
polilinker.
 Un fragmento de DNA de fago filamentoso:
proviene de una region intergenica del fago1, esta
region se emplea cuando se quiere replicar un DNA
en forma de monohebra.
 Un gen de resistencia a ampicilina
 Una secuencia Origen de Replicacion ColE 1 ori.
 Cromosomas artificiales
bacterianos BACs
 Contienen sitios de enzimas de restricción adecuadas y un
marcador como un gen de resistencia al cíoranfenicol.
 El plásmido modificado es escindido en un sitio de
restricción, y se inserta un fragmento de DNA foráneo de
hasta 300 kilobases de longitud mediante la DNA ligasa.
 El BAC se reproduce en E. colí tras su inserción en la
célula mediante electroporación.
 Este vector es fácil de reproducir y manipular y no sufre
recombinación con la misma facilidad que los YAC.
 Debido a que pueden transportar fragmentos tan grandes
de DNA, los cromosomas artificiales han sido
particularmente útiles en la secuenciación del genoma.
Cromosoma artificial bacteriano (BACs)
YAC

Los cromosomas artificiales de levaduras (Yeast Artificial Chromosome)

(YAC) es capaz de llevar fragmentos de DNA muy largos (hasta 2 Mb), pero
la eficiencia de transformación es muy baja.

 Centromeros (CEN)

 Telomeros (TEL).

 Secuencias replicantes Autónomas (ARS.

para proliferación en la cel. hospedera.

 ampr para amplificación selectiva

 Marcadores de selección tales como TRP1 y

URA3.

 Sitios de clonación para ER (e.g., EcoRI y

Bam HI)
 Cromosomas artificiales de
levadura YACs
 Estos vectores han sido diseñados para replicares en
levadura como cromosomas normales, pero ellos tienen
sitios donde el DNA puede ser insertado.
 En la estructura de los YAC-s, estos deben tener:
 - un origen de replicación
 - telomeros en los extremos
 - centromeros (1)
 - un sitio de clonamiento
 - un gen para selección

 Capacidad : 200 a 800 kb pueden ser insertados

El cromosoma artificial de
levadura (YAC s)
 PLASMIDOS:
Límite clonado 0.1- 10 Kb
FAGOS:
Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb
 COSMIDOS:
Combinación fago l y plásmido, 35-50 Kb
 BAC (Bacterial Artificial Chromosomes)
Derivados plásmido F, 75-300 Kb
 Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb
 YAC (Yeast artificial Chromosome)
cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb
4.- OBTENCIÓN DE LA MOLÉCULA
DE DNA RECOMBINANTE
1.- Unión fragmentos DNA a través complementaridad
de extremos cohesivos. Acción de DNA ligasa para
restablecer enlaces fosfodiester
2.- A través de
secuencias
unidoras
complementarias
entre si en ambas
moléculas
3.- A través de unión de secuencias unidoras que sean
reconocidas por una enzima de restricción.
PASOS PARA CLONAR CON LAMBDA
 separación del vector DNA desde las partículas del
fago y digestión con la apropiada enzima de
restricción
 conexión de los dos fragmentos lambda al fragmento
del DNA foráneo usando la DNA ligasa
 empacar el DNA por adición de extracto celular
conteniendo las proteínas de la cabeza y la cola
 infección de E. coli y separación de los fagos clonados
 chequeo de los fagos recombinantes por la presencia
del DNA foráneo.
 Fragmentos de DNA mayores de 20 kb no
pueden ser eficientemente clonados.
Unión del Gen Inserto al Fago
Lambda
PASOS PARA
CLONAR CON
YACs
5.-INTRODUCCIÓN DE LA MOLÉCULA
DE DNAr A LA CÉLULA HOSPEDERA
Técnicas de
permeabilización celular.
 Se trata de técnicas que permiten mantener
las células vivas inmersas en una solución
durante un periodo de tiempo que no suele
superar las pocas horas en condiciones tales
que presentan gran cantidad de orificios en
la membrana. Cualquier molécula añadida a
la solución que las rodea penetra en la
célula gracias al gradiente de concentración.
Se obtienen mediante tratamiento suave
con detergentes que solubilizan
parcialmente las membranas.
 Transformación: incorporación del
plásmido recombinado a las bacterias
 Transformación: CaCl2

-- -- --
--
-- -- -- --
-- -- -- -- Ca Cl2
+ + +- -- + +
+
-- -- -- +
+ +
+ + -- -- --
+ + -- --
+ + -- -- --
Bacteria
+
-- -- -- +
+
-- -- + + --
-- -- -- + + -- --
+ + + + -- --
+ + + +
-- -- -- -- -- --
Plasmidos
-- --
-- -- --
TRANSDUCCION
Técnicas de microinyección

La microinyección es una tecnología que permite la

introducción mecánica de soluciones en el interior
de la célula mediante una micropipeta que se
controla con la ayuda de un micromanipulador bajo
un microscopio. Es una técnica muy sensible, que
requiere una gran especialización del personal que
la realiza y un equipo delicado, sofisticado y
costoso.

Los instrumentos modernos de microinyección

manipulados por personal experto permiten realizar
algunas decenas de inyecciones por hora de trabajo.
Microinyeccion
 Electroporación.

 Este método sirve para introducir DNA en bacterias,

células eucariontes y también vegetales.

 La electroporación o electro transformación consiste en

someter las células bacterianas a un campo eléctrico de
12.000 volts/cm en cubetas de 0.1 a 0.4 cm de ancho.
En estas condiciones se generan poros en la membrana
que permiten la entrada del DNA.

 Las células vegetales requieren un tratamiento previo

para convertirlas en protoplastos antes de someterlas a
electroporacion
ELECTROPORACIÓN

DNA

PULSE

Sitio de
permeación
Biobalística

Uso de microproyectiles de tungsteno recubiertos con

DNA los cuales literalmente se disparan sobre la
célula blanco. Este método es para utilización en
vegetales. Tiene la ventaja de permitir la introducción
de DNA incluso en organelos como mitocondria y
cloroplasto.
Biolistica:
microproyectiles de DNA
Equipo de Biolistica
6. SELECCIÓN Y
RECONOCIMIENTO DE
CELULAS TRANSFORMADAS
 Antibiotico

Antibiotico

Purificación del Verificar el fragmento

plásmido clonado
Selección de las células transgénicas
resistentes al antibiótico
 SELECCIÓN CUANDO SE
UTILIZA PLASMIDOS pUC
 Deteccion de colonias con Vector pUC

X-Gal+IPTG

Colonias azules=celulas no transformadas

Colonias blancas= celulas transformadas
Sistema de Tamizaje de las células transformadas
 lacZ gene: Beta-galactosidase
Plasmid

Cut plasmid for ligation

in lacZ region

Ligar genomic DNA

No Beta-galactosidase produced!

Amplify in X-gal and

IPTG

Select white colonies

Métodos de detección de
la clona con el inserto por
hibridación in situ Caja petri con colonias

Transferencia a filtro

Detección de las
bacterias transformadas
con el gen de interés
Deteccion de celulas transformadas
GEN MARCADOR GPVF
APLICACIONES PRACTICAS DE INGENERIA
GENETICA

•-FERMENTACIONES MICROBIANAS

•La ingeniería genética ha permitido manipular la producción del

antibiótico en orden a aumentar el rendimiento o producir
antibióticos modificados.

•-VACUNAS
•Por ingeniería genética los genes virales de la proteína de la
cubierta pueden ser clonados y expresados en bacteria haciendo
posible el desarrollo seguro de vacunas.

•-PROTEINAS ANIMALES
•El clonamiento de genes para una proteína humana en bacteria
para su producción comercial.
 PLANTAS Y ANIMALES TRANSGENICOS

 A través de estos se puede llegar a aumentar la

productividad, alterar la calidad nutricional,
producir ciertas proteínas. Por introducción del
DNA clonado en los huevos fertilizados de
animales, o directamente en la células vegetales
crecidas en cultivo de tejidos, es ahora posible
obtener organismos superiores modificados.
 -BIOTECNOLOGIA DEL MEDIO AMBIENTE

 Algunas bacterias poseen genes que codifican

para proteínas que degradan contaminantes
ambientales.
 Algunos ejemplos: genes para la
biodegradación de pesticidas clorados como
clorobenzenos.
 Algunos plasmidos han sido construidos
conteniendo genes para la biodegradación de
varios químicos tóxicos.
-REGULACION DE GENES Y
TERAPIA GENETICA

 Muchas investigaciones han involucrado el

control de la expresión de genes específicos.
 La mayoría de las investigaciones han
llegado al diseño de RNA antisentido y
ribozimas que regulan la expresión de
genes específicos y ahora es posible curar
algunas enfermedades genéticas por la
introducción del gen defectuoso o por
inhibición de algún gen sobre expresado .
 PRINCIPALES PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS
HECHOS POR TECNICAS DE DNA RECOMBINANTE
 PRODUCTO
 PROTEINAS SANGUINEAS
 - activador de plasminogeno tisular
 - factores VII, VIII, IX
 - eritropoietina
 - uroquinasa
 HORMONAS
 - Insulina
 - Hormona de crecimiento
 - Factor crecimiento epidérmico
 - Hormona paratiroides
 - beta-endorfina
 - Factor crecimiento óseo
 - Atriopeptina
FUNCION
- disuelve coágulos
- promueve la coagulación
- crecimiento glóbulos rojos
-coagulcion sangre
- tratamiento de diabetes
- tratamiento de enanismo
- daño por quemaduras
- regulación del calcio
- alivia el dolor
- osteoporosos
- diurético, antihipertensivo
 IMMUNO MODULATORES

 - Interferones - agentes
anticancerígenos y
 antivirales
 - Interleukina 2 T - estimulador células
 - Factor necrosis tumoral - agente antitumoral
 - Factor estimulación de colonia -tratamiento de
infecciones y cancer
 - Lisozima - anti-inflamatorio

 VACUNAS

 - Hepatitis B - prevención hepatitis

 - Citomegalovirus - prevención infección
 - Sarampión - prevención
sarampión
 - Cólera - prevención cólera
 - AIDS - prevención SIDA
 - Rabia - prevención rabia
ANIMALES TRANSGENICOS
PLANTAS TRANSGENICAS
PLANTAS TRANSGENICAS
PLANTAS RESISTENTES A
INSECTOS
PLANTAS TRANSGENICAS
FARMACOGENETICA
FARMACOS
 Insulina Humana
Acción Rápida
Regular (Insulina Zinc
Humana Regular
(Origen ADN
Recombinante) Área
terapéutica:

 Endocrinología Familia:
Humulin Vial de 1
pz Solución inyectable de
100 UI Fabricado por: Lilly
México, México
TERAPIA GENICA
Lucha contra los transgenicos