TÉCNICAS BÁSICAS APLICADAS EN BIOTECNOLOGÍA

Olga Yaneth Echeverri P. PhD.

oyecheve@javeriana.edu.co
 UNA DEFINICIÓN

"Biotechnology is the application of living organisms to develop new

products or improve existing ones. Current biotechnology methods, which
allow the transfer of a gene from one organism to another, involve the
same basic scientific processes —crossbreeding and fermentation —
people have used for centuries to increase crop productivity, improve the
food supply and produce better foods."

Committee on Opportunities in the Nutrition and Food Sciences, Food and Nutrition Board, Institute of Medicine
APLICACIONES

Agricultura

Ecosistema Salud

Biotecnología

Medio
Ganadería
ambiente
 APLICACIONES AGRÍCOLAS

 Mejoramiento de cultivos
 Mejoramiento del contenido nutricional de frutas y
verduras
 Cultivos resistentes a plagas.

"It is the position of The American Dietetic Association that

biotechnology techniques have the potential to be useful in
enhancing the quality, nutritional value and variety of food
available for human consumption and in increasing the
efficiency of food production, food processing, food distribution
and waste management."
 IMPLICACIONES AMBIENTALES

Reducción del impacto ambiental de los

procesos tecnológico.
Menor uso de pesticidas
Mayor recuperación de suelos
Conservación de la calidad del agua
 Generación de menos residuos
 APLICACIONES EN GANADERÍA

 Salud Animal (vacunas)

 Manipulación genética para mayor
producción (leche, carne, huevos)
 Control del contenido nutricional de los
productos animales
APLICACIONES EN SALUD

 Producción de: Hormonas, Interferones,

Vacunas, Vitaminas y ácidos orgánicos,
Alcoholes, Antibióticos, Enzimas.

 Desarrollo de técnicas de diagnóstico.

TÉCNICAS BÁSICAS

Métodos que nos permiten manipular los

ácidos nucleicos y las proteínas para
investigación in vitro e in vivo.
 ¿CÓMO PODEMOS HACER
BIOTECNOLOGÍA?

 Buscando el gen o proteína de interés

 Cortando y pegando ese material
 Moviendo y reubicando el material genético
 Leyendo e interpretando los mensajes
 Amplificándolo, duplicándolo y modificándolo
TÉCNICAS DE
SEPARACIÓN

CENTRIFUG ACIÓN

C R O M AT O G R A F Í A

ELECTROFORESIS
 CENTRIFUGACIÓN

Método básico de separación su fundamento principal

es separar sólidos de líquidos. Aprovecha la
propiedad de las partículas solidas de desplazarse
con una fuerza o aceleración determinada en un
campo centrífugo .

Preparativa (separación básica)

Analítica (datos moleculares)

Schotter y Dubrunfaut en 1848

 CENTRIFUGACIÓN

Tipos de Centrifugación
Diferencial (densidad)

Zonal (velocidad de sedimentación)

Ultra centrifugación (sedimentación

subcelular)
 ELECTROFORESIS

Método de separación que aprovecha la capacidad de las moléculas que

poseen carga neta para desplazarse desplaza en respuesta a la
aplicación de un campo eléctrico hacia el cátodo (+) ó hacia el ánodo
(-) y a diferentes velocidades

Factores de velocidad de migración o movilidad a través del campo

eléctrico
 Carga neta,
 tamaño y
 forma de las moléculas
 Fuerza iónica,
 Viscosidad
 La temperatura del medio

Leonor Michaelis
(January 16, 1875 – October 8, 1949)
 ELECTROFORESIS
Diferentes clases:
 Capilar: volúmenes de muestra de 0,1 a 10 nL, rápida, especifica y
reproducible.
 Electroforesis en Gel:
 Agarosa: ADN, ARN (migración del electrodo negativo al positivo debido a la carga negativa presente en el
esqueleto azúcar – fosfato)
 Poliacrilamida: proteínas
 En papel: sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y
péptidos
 Isoelectroenfoque: PAGE en una dimensión separa por puntos
isoeléctrico
 Bidimensional: combina el isoelectroenfoque (1a dimensión) con la
SDS-PAGE (2da dimensión)
 Zimografía: condiciones no reductoras para actividad enzimática.

http://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM
CROMATOGRAFÍA

Método de separación que se basa en el

desplazamiento de las moléculas sobre una fase
estacionaria trasportadas por una fase móvil en
condiciones controladas.
Cromatografía en papel.
En capa fina.
Liquida.
De gas.
De Fluidos Supercríticos.

Mijaíl Semiónovich Tsvet

1872 - 1919
 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Técnicas de Hibridación
Southern Blot
Northen Blot
Western Blots
ELISA
• Técnicas de Cuantificación
 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR

K. Kleppe, E. Ohtsuka, R. Kleppe, I. Molineux, H.G. Khorana.

1971. Studies on polynucleotides: XCVI. Repair replication of
short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.
Journal of Molecular Biology. 341-361.
Kary Banks Mullis. En 1985, mientras seguía trabajando en
Cetus, desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa. Ganó premio Nobel de Química de 1993.

(28 de diciembre de 1944,

Carolina del Norte).
 PCR

Sirve para amplificar una secuencia especifica de DNA

Para la síntesis in vitro se requiere:

 DNA molde

 Oligonucleótidos o Primers:
Secuencias de ácidos nucleicos sintéticas y complementarias
Sirven como inicio de replicación del ADN

 Buffer de amplificación (KCl, Tris y MgCl2)

PCR

 DNA polimerasa termoestable (Taq):

 Enzima aislada de la bacteria Termophilus acuaticus.
 Incorpora nucleótidos libres en el extremo 3’ del primer unido a la cadena
principal; formando así una cadena complementaria.
 Soporta temperaturas elevadas y mantiene una media de extensión de 60
nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C

 dNTPs (ATP, CTP, GTP, TTP):

 Desoxinucleótidos con dos átomos de fósforo adicionales
 Se agregan en concentraciones superiores a lo establecido, se gastan en la
reacción rápidamente
 La concentración de dNTPs y MgCl2 va relacionada
 La enzima necesita de Mg para poder incorporar a los dNTPs
 PCR - CICLO

Denaturación por calor (~95°C)

 Separa las dos hebras del DNA molde de doble hélice

Anillamiento (≤60°C)
 Unión de Primers a la secuencia complementaria
 Taq polimerasa extiende cada primer.
 Provee el grupo de su extremo 3´ por la polimerización de dNTPs

Extensión (60-72°C)
 Elongación de la cadena mediante la DNA polimerasa
 RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTION
POLYMERASE CHAIN REACTION)
Variante de PCR

Una hebra de ARN es retrotranscrita en ADNc usando

transcriptasa reversa

Amplificación de ADN en un PCR tradicional.

Cuidado en la manipulación y contaminación de las

muestras con RNAsas
SECUENCIACIÓN MASIVA:
SISTEMAS NGS (NEXT GENERATION SEQUENCING), TAMBIÉN LLAMADA MPS (MASSIVE
PARALLEL SEQUENCING) O HIGH THROUGHPUT SEQUENCING (HTS)

 Sistema 454 de Roche (con intención de ser discontinuado en 2016). La

pirosecuenciación.

 Sistema Illumina (antes Solexa) (el más usado hoy día). Secuenciación
por síntesis.

 Sistema SOLiD de Life Technology (de Applied Biosystem).

 Sistema de secuenciación de Ion Torrent e Ion Proton (Applied

Biosystem). Cambios del pH por liberacion de iones H+
 Otros Sistemas: Sistema y servicio de Complete Genomics
Sistema Polonator
Sistema Intelligent Biosystems de Qiagen.

Sistemas NGS de TERCERA GENERACIÓN que NO requieren

amplificación del ADN (Next Next NGS)

http://www.uco.es/users/bb1rofra/BiologiaSistemas/Tema6_Genomica/6.genomica.html
TECNICAS DE HIBRIDACIÓN
 SOUTHERN BLOT

Edward M. Southern

Detectar la presencia de una

secuencia de DNA en una
muestra
DNA complejo
La cantidad de DNA necesaria para
la técnica depende del tamaño y
actividad específica de la
muestra. Muestras cortas
tienden a ser más específicas.

Paso 1: Sonicación o Corte con

Desfragmentación del DNA Enzimas de restricción
 SOUTHERN BLOT

Paso 2: Electroforesis.

 Transferencia de fragmentos de DNA resueltos se transfieren

a una membrana de nylon o nitrocelulosa. (esencial)
 SOUTHERN BLOT

Paso 3: Marcado

 La membrana se incuba con una

sonda marcada radiactivamente
(específica)

 La membrana de nylon o
nitrocelulosa se cubren con un
film de rayos X.

 Después del revelado, las

posiciones de las sondas
marcadas son visibles
NORTHERN BLOT

Detección de secuencias de ARN

Expresión de genes ARNm

 Southern blot
http://highered.mcgraw-
hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/fre
e/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot

 Northern blot
http://www.youtube.com/watch?v=CwStfszlEms&feature=related
 WESTERN BLOT
Método en biología molecular / bioquímica / inmunogenética para la
detección de proteínas en una muestra.

PASOS:
 Corrido electroforético de las muestras
 Transferencia desde el gel hacia la membrana de nitrocelulosa.
 Incubaciones con anticuerpos específicos contra la proteína.
 Incubaciones con anticuerpos marcados con una enzima
 Revelado con sustratos específicos para la enzima
 Como resultado se observa la presencia de la proteína (s) de interés en una muestra
 Comparar los niveles de presencia entre varios grupos.
 Otras técnicas, también usando anticuerpos, permiten la detección de proteínas en
tejidos (inmunohistoquímica) y células (inmunocitoquímica)
 ELISA

ELISA acrónimo del Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. Es una técnica

inmunoenzimática, que se emplea para detectar la presencia de un
anticuerpo especifico en una muestra determinada.
La prueba utiliza un antígeno fijado en una placa sobre la cual se busca el
anticuerpo presente en la muestra, el complejo inmunológico formado
se visualiza después utilizando una reacción enzimática. especifica.
ELISA DIRECTA. Antígeno-Anticuerpo marcado
ELISA INDIRECTA. Antígeno-Anticuerpo primario-Anti.Anticuerpo marcado.
(VIH)
ELISA EN SANDWICH. Anticuerpo-Antígeno-Anticuerpo marcado

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
 OTRAS TÉCNICAS.
TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN

Espectrometría.
Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra
una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por
parte de la sustancia
Ley de Beer. La absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración y la longitud del paso de luz.

http://www.espectrometria.com
 OTRAS TÉCNICAS.
TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN

Fluorometría
La fluorescencia es un fenómeno por el cual algunas sustancias
tienen la capacidad de absorber luz a una determinada
longitud de onda, por lo general en el rango ultravioleta, y
luego emiten luz en una longitud más larga. Dicho de otra
manera, absorben fotones con una determinada energía, y
liberan fotones con menor energía
PRÓXIMA CLASE TALLER DE TÉCNICAS EN BIOTECNOLOGÍA.
1. seleccionar un articulo

2. seleccionar una técnica

3. Preparar los conceptos de la técnica seleccionada:

fundamento, aplicaciones, ventajas y desventajas.

4. proponer un ejemplo de un experimento donde

utilizaría la técnica seleccionada, por qué y para qué.