EVALUACIÓN DE TRES

MÉTODOS RÁPIDOS PARA

DETECCIÓN DE LA RESISTENCIA
A LA METICILINA EN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

CALDERÓN DÁVILA ARTEMIO

TORRES CORDERO ANA MARÍA
 EVALUACIÓN DE TRES MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA
DETECCIÓN DE LA RESISTENCIA A LA METICILINA
EN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
• La resistencia a la meticilina en Staphylococcus aureus (MRSA) se ha ido incrementando a lo largo
del mundo .
• En los Estados Unidos y en algunos países europeos, el MRSA representa del 10 al 40% de
toda S.aureus
• El aumento de la vigilancia, incluida la detección de pacientes de alto riesgo, ha sido reconocido
como un componente importante de los programas de control de infecciones eficaces para limitar
la propagación del SARM en los hospitales.
• Por lo tanto, la rápida y precisa identificación de MRSA es esencial
• Sin embargo, el uso de estos ensayos se limita en gran parte a los centros de referencia, y no se
utiliza actualmente para la mayoría de los laboratorios de diagnóstico de rutina.
 MATERIALES Y MÉTODOS
• 397 aislamientos clínicos bien caracterizado de S. aureus:
 163 cepas sensibles a la meticilina (MSSA) (MIC oxacilina, ≤ 1 mg / ml; mecA negativo),
197 cepas de MRSA(MIC oxacilina, ≥ 4 mg / ml; mecA positivo)y
37 cepas BORSA (MIC oxacilina de 2-8 mg / ml; mecA negativo).
• Todos los aislamientos se almacenaron congelados con glicerol tamponado a -70 ° C y
se subcultivaron dos veces en agar de soya Trypticasa suplementado con 5% de sangre
de oveja antes de las pruebas.
• Todos los aislados fueron sometidos a pruebas de "ciego" con el ensayo Velogene, el kit
de prueba de MRSA-Screen, la prueba de BBL Crystal MRSA ID, prueba en placa de
oxacilina en agar y la determinación de los MIC por pruebas de microdilución.
• Las cepas control utilizadas para todos los ensayos incluyeron las cepas de MRSA ATCC
33592 y ATCC 43300 y la cepa MSSA ATCC 29213.
 ENSAYO DE IDENTIFICACIÓN DE MRSA RÁPIDO VELOGENE
• Se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
• un asa de siembra de 1 ul de crecimiento a partir de una placa de agar sangre se suspendió en 50 ml de
buffer lisis y se incuba a 55 ° C durante 20 min.
• La suspensión estuvo entonces incubada en un baño seco a 95 ° C durante 5 min.
• Se adicionó alícuota de 50 ul de reactivo de cycling y la suspensión fue incubada a 55°C por 25 minutos. El
reactivo de detención de ciclo fue añadido y la suspensión fue transferida a pocillos de microtitulación
cubiertos con estreptavidina, siendo incubados a una temperatura ambiente durante 10 minutos. Después
de dos lavados, se añadió el reactivo detección de sustrato.
• El desarrollo de un color azul es indicativo de la suceptibilidad a la meticilina (mecA negativo); una
reacción incoloro indicó la presencia de una cepa resistente a la meticilina (mecA positivo).
• Los resultados de la prueba podrían determinarse espectrofotométricamente o por inspección visual. Para
esta evaluación, se utilizó la inspección visual para determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo.
 MRSA-SCREEN
• Se realizó según las instrucciones del fabricante:
• Un asa de siembra de 1 ml de la muestra se emulsiona en 4 gotas de un reactivo de
extracción y se hierve durante 3 min.
• Esta suspensión fue luego enfriada a temperatura ambiente, se añadió 1 gota de un
segundo reactivo de extracción y mezcló.
• Esta suspensión se centrifugó a 1500 rpm por 5 min.
• Se añadió alícuota de 50 ml del sobrenadante a cada uno de los círculos de la cartilla de
prueba y mezclada con una gota de anticuerpo monoclonal anti-PBP 2a sensibilizado en látex
y una gota de látex de control negativo, respectivamente.
• Las muestras se mezclaron durante 3 minutos en un agitador, y se observó visualmente la
aglutinación.
 BBL CRYSTAL ID MRSA
• Realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• El inóculo se incubó a 35 ° C durante 4 h, y la fluorescencia en los pocillos se observó
mediante un panel de iluminación con luz UV de onda larga.

PRUEBAS EN AGAR DE SUCEPTIBILIDAD A LA OXACILINA

• La prueba de sensibilidad a los antimicrobianos se realizó usando una placa de agar con
oxacilina ( Agar Mueller-Hinton suplementado con 4% de NaCl y 6 mg de oxacilina por ml)
y por microdiluciones fueron evaluadas de acuerdo con los estándares del comité de
laboratorio clínico (NCCLS)
 PCR MÚLTIPLE
• Se realizó PCR para la detección de mecA y nucA. El gen nucA es responsable para la producción de una nucleasa
termoestable fue incluida en el ensayo de la prueba de PCR múltiple para confirmar los aislamientos indicados de S.
aureus y no de otra especie de Staphylococcus
• El ADN bacteriano fue extraído usando dos a tres colonias de un organismo de prueba crecido en una placa con agar
sangre de oveja al 5% y después se hirvió durante 10 min en 100 ml de tampón de lisis Triton X-100 (NaCl 100 mM, 10
mM Tris-HCl [pH 8], 1 mM EDTA [PH 9], y 1% de Triton X-100).
• La suspensión se enfrió a temperatura ambiente durante 5 min y se centrifugó a 14.000 rpm durante 1 min. Luego 1 ml
del sobrenadante se utilizó como la plantilla.
• PCR se realizó en un volumen de 25 ml,con 13 ml tampón de PCR que contiene 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), KCl 50 mM, 1,5
mM, MgCl2, concentración de 200 mM de cadatrifosfato desoxynuclueósido, 2,5 U de Taq polimerasa, y las
concentraciones de 0,2 mM de cada cebador.
• Las condiciones del termiciclador GeneAmp 9600 (PE Biosystems, Mississauga, Ontario,Canadá) fueron las siguientes:
94 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C para 1 s y 55 ° C por 15 s, con una extensión final de 10 min a 72 ° C.
• Las primeras secuencias de los cebadores para mecA y nucA son mostradas en la Tabla 1. Los organismos de control
incluyen S. aureus ATCC 43300, S. aureus ATCC 25923 y S. epidermidis ATCC 12228.
• La electroforesis fue a a 100 V durante 40 min fue realizada para separar los productos en 1% 13 TBE (Tris 8,9 M, ácido
bórico 8,9 M, y EDTA 0,2 M) en geles de agarosa.
• El gel se baño con bromuro de etidio y fotografiados bajo iluminación UV.
 RESULTADOS
TABLA 1 Resultados de 397 cepas de S. aureus con Identificación rápida de
MRSA por Velogene, MRSA-Screen y Sistema de Cristal BBL MRSA ID, prueba en
placa de oxacilina y PCR mecA

aPara los primeros 5 test, la sensibilidad y especificidad de la detección de la Resistencia a la meticilina fue
de 98.5 y 100%, 98.5 y 100% , 98.5 y 98.0, 99.0 y 88.5 % y 100 y 100% respecivamente
b Para este método el números de cepas mostraron crecimiento (1) o no crecimiento (2)
TABLA 3: Discrepancias entre las evaluaciones deteción de MecA por PCR,
Prueba Rápida de Identificación de MRSA por Velogene, MRSA – Screen ,
Sistema Cristal BBL MRSA ID y prueba en placa de agar con oxacilina

a mecA prueba negative, ; 1, mecA prueba positiva.

b no agglutinacion (PBP 2ausente); 1, agglutination (PBP 2a presente).
c no fluoresce (no crecimiento en oxacilina 4 mg/ml ); 1, fluoresce (crecimiento en oxacilina 4 mg/ml).
d OXA6, prueba en agar con oxacilina; growth: crecimiento después de 24 horas de incubación
no growth: no crecimiento después de 24 horas de incubación
 DISCUSIÓN
• La prueba rápida de identificación de MRSA por Velogene fue rápida y fácil de
realizar, proporcionando resultados en aproximadamente 90 min
• El MRSA-Screen detecta con precisión el producto del gen mecA, PBP 2a, en casi
todas las cepas de prueba de MRSA
• Resultados falso negativo se produjeron con tres de los aislados MRSA con MIC
para oxacilina de 4 u 8 mg / ml.. La cepa control S. aureus ATCC 43300 (MIC
oxacilina de 8 mg / ml) , también dio un resultado negativo con un inóculo de
solo 1 ml (un asa)
• las cepas de MRSA que inicialmente no lograron aglutinar con el ensayo de
MRSA-Screen se evaluaron de nuevo después de la incubación en el con
presencia de un disco meticilina 5-mg con el fin de aumentar el nivel de
expresión 2a PBP.