Curso Posgrado

Ciencias y Tecnologías Químicas

Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como

catalizadores

Inmovilización de enzimas
Curso Posgrado 2012

VENTAJAS DE INMOVILIZAR ENZIMAS

• Enzimas en forma de catalizadores heterogéneos

• Posibilidad de reutilización del catalizador

• No necesidad de separar la enzima de los productos de reacción

• Mayor versatilidad en elección de reactores

• Mejora de las propiedades (actividad, estabilidad y selectividad)

• Mejora del control de los procesos

Curso Posgrado 2012
ESTABILIZACION POR INMOVILIZACIÓN PURA

No hay agregación
No hay interacciones con interfases
No hay posibilidad de proteolisis

Las burbujas de gas o gotas de disolvente no pueden penetrar en los poros

Las moléculas de enzima están dispersas
 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
Curso Posgrado 2012

No todos los métodos de inmovilización estabilizan todas las enzimas

 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR MÉTODOS DE ADSORCIÓN
Curso Posgrado 2012

• Método muy simple

• Este método permite valores elevados de carga enzimática

• Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van

der Waals, efectos hidrofóbicos y de carga iónica

• La selección del soporte pasa por su capacidad de retener la

enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno del liquido,
actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y
costo.

• Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas

neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas (quitina,
intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia
inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica porosa).
 MECANISMO DE LOS PROCESOS DE ADSORCIÓN
Curso Posgrado 2012

-
- - - ---
-
-
-
- -
+ + + +

Adsorción por mecanismo de intercambio multipuntual

 DISEÑO DE NUEVOS SOPORTES PARA LA INMOVILIZACIÓN
MUY SENCILLA Y REVERSIBLE DE ENZIMAS
Curso Posgrado 2012

 Reuso del soporte/ reactor

 Adsorciones físicas muy fuertes

 Efecto estabilizante: Adsorción multisubunidades de

proteínas multiméricas

 Soportes muy estables

 Condiciones de inmovilización muy suaves

 No es necesario bloquear
 INMOVILIZACIÓN REVERSIBLE SOBRE
SOPORTES RÍGIDOS RECUBIERTOS DE POLÍMEROS POLIFUNCIONALES
Curso Posgrado 2012

NH3+
-
COO
SO4-2
 Gran concentración de grupos: adsorción fuerte

Biotechnol. Bioeng. 2000. 68, 98-105.

Biotechnol. Progr. 2004. 20, 284 - 288
Biotechnol. Progr. 2004. 20, 1134-1139.
 COMPARACIÓN DE SOPORTES PEI FRENTE A SOPORTES CONVENCIONALES:
ADSORCIÓN DE INVERTASA DE SACCHAROMYCES CEREVISAE
Curso Posgrado 2012

ADSORCIÓN A SOPORTES PEI DESORCIÓN A pH 7

100

Actividad desorbida, %
100

Suspensión 75
75
Actividad, %

50
50

25
25
Sobrenadante
0
0
0 200 400 600 800 1000
0 1 2 3 4 5
[NaCl] (mM)
Tiempo (min)

Biotechnol. Progr. 2003. 18, 1221-1226.

 INACTIVACIÓN TÉRMICA DE INVERTASA ADSORBIDA SOBRE
SEPABEADS - PEI

Curso Posgrado 2012

100

75 Sepabeads-PEI
Actividad remanente, (%)

DEAE
50

25

Enzima soluble
Tª 55º C
0 pH 7
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)

Enzimas multiméricas : Adsorción multi-subunidades

Biotechnol. Progr. 2003. 18, 1221-1226.

 SOPORTES RECUBIERTOS DE POLÍMEROS

Curso Posgrado 2012

 Adsorciones muy rápidas y sencillas

 Adsorción más fuerte que soportes convencionales

 Adsorción muy poco distorsionante (actividad 100%)

 Adsorción estabilizante: adsorción multi-subunidades

estabilización frente a disolventes
 Permiten reuso del soporte/reactor

Métodos sencillos y eficientes de mejorar

las propiedades de las enzimas
 Adsorción de Proteínas Recombinantes sobre Quelatos Metálicos

Curso Posgrado 2012

Adsorción unipuntual a través de una

interacción muy fuerte con único quelato

His
- His
COO
+2
Me His

COO
- His His
His

His Proteínas naturales

His

Proteínas recombinantes con Adsorción multipuntual a través

colas poli-His de varios grupos quelato
 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE COORDINACIÓN A METALES
Curso Posgrado 2012

His
Enzimas naturales

His

Adsorción multipuntual a través de varios grupos quelato

His His Enzimas

COO-
recombinantes
Zn+2 His con colas poli-His
COO-
His

Adsorción unipuntual a través de una interacción muy fuerte

Curso Posgrado 2012 UNION COVALENTE

 Posibilidad de estabilización por

unión multipuntual
La unión de la enzima al soporte
es muy fuerte

Tras inactivación hay que

eliminar el soporte y la
enzima
Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada
previa a su utilización
 ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE PROCESOS DE INMOVILIZACIÓN

Curso Posgrado 2012 MECANISMOS DE INACTIVACIÓN DE ENZIMAS

M. acuoso Alta temperatura

pH neutro Disolventes
4º C pHs extremos

+ + +

Rigidificación de la estructura 3-D

Estabilización de la estructura cuaternaria
 MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN
Curso Posgrado 2012

 RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D

 ESTABILIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA

+
 ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR
Curso Posgrado 2012
INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL

 Muchos residuos de la enzima

 Brazos espaciadores muy cortos
 Soporte rígido

Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional

inducido por cualquier agente distorsionarte

ESTABILIZACIÓN 3-D

COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES

 RIGIDIFICACIÓN DE DIFERENTES REGIONES
Curso Posgrado 2012

Región más rica en lisinas Región cercana al centro activo

Bucle inestable
Curso Posgrado 2012

GRUPOS AMINO

¨
NH  Muy reactivo cuando está ionizado
2

 Mayoritariamente en la superficie

 Abundante

Amino terminal (pK=7.5) … muy reactivo a pH neutro

Lisinas (pK=10.5) ……… poco reactivas a pH neutro
 INMOVILIZACIÓN SOBRE SOPORTES CON GRUPOS MUY REACTIVOS
(glutaraldehído, CNBr, etc)
Curso Posgrado 2012

+
NH3

¨ 2
NH +
NH3

+
-OH NH3
+
NH3

Reactividad mayor en el amino más reactivo (pk 7,5 <<< 10.7 (lys)
Muy difícil rigidificar la superficie a pH alcalino
 GRUPOS MUY POCO REACTIVOS
Curso Posgrado 2012

Reaccion intermolecular muy lenta

+
NaBH4
Bases de Schiff muy inestables

En principio muy poco útiles para la unión covalente enzima-soporte a pH neutro

pero los hemos convertidos es los mejores para inmovilización estabilización
 LOS RESIDUOS Y LA REGION

Curso Posgrado 2012

..
- NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación)

Los grupos amino: un amino terminal muy reactivo

y numerosos residuos lisina poco reactivos

La región : a.- el amino mas reactivo

b.- las mas ricas en grupos amino
 INMOVILIZACIÓN POR EL AMINO MÁS REACTIVO
Curso Posgrado 2012

O O

NH 2
N N O OH
H H2

NH3+
NH3+

NH2

NH3
NH3

O O

N O N
H2 H
 INMOVILIZACION DE ENZIMAS
A TRAVÉS DE SUS GRUPOS AMINO
Curso Posgrado 2012

+ NH +
NH3
3

H2N R’
+ H2N R
H2N

O
O CH2 C + H2N R
H
 LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS
Y SOPORTES GLIOXIL
Curso Posgrado 2012

NH2 NH2

H2N

H2N

H2N
H2N
pH 8.0 (NO)
pH 10.0 (NO)
NH2

H2N
Regiones muy ricas
H2N en grupos aminos
H2N
H2N
pH 10.0 (SI)
 EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN
ENZIMA - SOPORTE
Curso Posgrado 2012

.........

Tiempo hasta 72 horas después del final de la primera inmovilización

Temperatura (25 ºC >>> 4 ºC)
 PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION
ENZIMA-SOPORTE
Curso Posgrado 2012

O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H

CH N O CH2 CH2 NH
O CH2

NaBH4
O CH2 CH N O CH2 CH2 NH
1mg/ml
O CH2 CH N
O CH2 CH2 NH

O
O CH2 C O CH2 CH2OH
H
 LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO

Curso Posgrado 2012

 Muy estables y muy cercanos al soporte rígido

 Reacción unipuntual reversible con grupos amino

a.- orientación adecuada para inmovilización multipuntual
b.- multi-interacción no distorsionarte

 Ausencia de impedimentos estéricos

O ..
O CH2 C NH2
H
 Modificación química mínima
+ +
E NH3 E NH2 CH2 CH2 O

 Soportes completamente inertes e hidrofílicos

 SOPORTES GLIOXIL PARA LA
ESTABILIZACION DE ENZIMAS
Curso Posgrado 2012

O
O
C
C
O H
H
C O O
H
C C
O
H H
C O
H
C
H

alta densidad superficial de grupos glioxil, µEq. / m2

 Soportes formados por grandes superficies con un elevado grado de activación

 Brazos espaciadores muy pequeños
 La enzima se inmoviliza siempre por regiones muy ricas en NH2
 Los grupos glioxil son muy estables y no tienen impedimentos estéricos
durante la multi-interacción
 La modificación química de la enzima es mínima
 ENZIMAS ESTABILIZADAS
POR INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL
Curso Posgrado 2012 SOBRE SOPORTES GLIOXIL

ENZIMA ACTIVIDAD ESTABILIZACION

Tripsina 75% 10.000

Quimotripsina 70% 60.000
Penicilina G acilasa de E. Coli 70% 8.000
Penicilina G acilasa de K. citrophila 70% 7.000
Ferredoxina NADP reductasa de Anabaena 60% 1.000
Lipasa de C. rugosa 50% 150
Glutamato racemasa 70% 1.000
Esterasa de B. stearothermofilus 70% 1.000
Termolisina de B. thermoproteolyticus 100% 100

>>>
estable
Curso Posgrado 2012

Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos

 No inmoviliza soportes muy activados a pH 7.0

 No inmoviliza soportes poco activados a pH 10.0
 Inmovilizacion muy rapida sobre soportes muy activados a pH 10.0
 Inmovilizacion muy rapida de tripsina (autolisada) sobre soportes
muy activados a pH 7.0
 Efecto espectacular de la concentracion de grupos activos
sobre la velocidad inmovilización
 Efecto espectacular de la temperatura sobre la
velocidad de inmovilización
 Estabilización muy elevada de todas las enzimas evaluadas

glioxil muy diferente de BrCN, glutaraldehido…

 Unión de enzimas con varios aminos terminales a soportes
Curso Posgrado 2012 activados con grupos glioxil pH 7

Hipótesis multiméricas:

NH2

NH2
NH2

pH 8
Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar
multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8
Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades
Curso Posgrado 2012
 LOS SOPORTES EPÓXIDO PARA LA UNIÓN COVALENTE
MULTIPUNTUAL.
Curso Posgrado 2012

NH2
O SH
H2N
O

OH
O

O
NH2 NH2
O

 Grupos estables
 Posibilidad de reacción con muchos residuos de la enzima
 Brazos espaciadores cortos
 Muchos grupos activados
 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO

Curso Posgrado 2012

O O

O
NH2
NH2
O ..
..
..
..
O NH2
NH2
O O

Inmovilización extremadamente lenta

Reacción amino-epoxido :
Intermolecular muy lenta
Intramolecular muy rápida e intensa
 MECANISMO DE INMOVILIZACIÓN-ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS A
SOPORTES EPÓXIDO
Curso Posgrado 2012

O
O

O NH3+
O
NH3+
NH3+ pH 7.0 NH3+
+
NH3 .. O NH3+ ..
O
NH2 Adsorción NH2
O
O
física
pH 7.0

.. O

NH2
O
NH3+
pH 10 NH3+
O NH3+

Interacción Inmovilización
multipuntual covalente

Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745

Nature Protocols. 2007. 2, 1022-33
Curso Posgrado 2012

OH O
NH 3+
+
H 2N
OH
O COO-
+
NH
COO-
COO- O
NH 2
NH2 H 2N +
COO-
O

COO- O
+ OH
1) H 2N B
COO- OH
O

2) Me+2 OH
O
+
NH2 H2N
OH O
COO-
+2
NH+ Me
B
O COO-
HO OH

Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745

 INMOVILIZACIÓN COVALENTE DE ENZIMAS DE UN EXTRACTO CRUDO
DE Escherichia coli EN DIFERENTES SOPORTES
EPÓXIDO HETERO-FUNCIONALES.
Curso Posgrado 2012

SOPORTE

Eupergit
Eupergit Cu+2 Eupergit boronato Eupergit – NH3+
Hidrofóbico*
Proteína
inmovilizada
70% >85% 75% 65%

Condiciones: pH 7 y 25ºC
* 1 M de fosfato sódico

La utilización secuencial de 3 soportes permite la inmovilización

de “todas” las proteínas del extracto.

Un alto porcentaje de enzimas se pueden inmovilizar

sobre diferentes soportes .... diferentes orientaciones.

Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745

 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN FUNCIÓN DEL SOPORTE

Curso Posgrado 2012

Epóxido NH2-Epóxido M+2-Epóxido

hidrofóbico
Lipasa C. rugosa 100 95 70

PGA E. coli 75 nd 75

-galactosidasa A.oryzae 0 95 0

-galactosidasa 40 35 95
Thermus.sp.T2
Epóxido hidrolasa A.niger 30 95 0

Biomacromolecules. 2000. 1, 739-745

 ESTABILIDAD TÉRMICA DE DIFERENTES DERIVADOS SEPABEADS
EPÓXIDO HETEROFUNCIONALES DE -GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2
Curso Posgrado 2012

100 Boronato-Epóxido

80 M+2-Epóxido
Actividad, (%)

60

40

20 NH2-Epóxido

0
Hidrófobico - Epóxido

Soluble
0 20 40 60
pH 6,5; 70ºC
Tiempo (horas)

Biotechnol. Progr. 2004. 20, 388 – 392.

 OPTIMIZACIÓN DE LOS SOPORTES HETEROFUNCIONALES

Curso Posgrado 2012

O
+

O
+

O
O +
+

O
O
+
+
O 2,5 0,25 +

INMOVILIZACION COVALENTE
O 2 0,2

ADSORCION 1,5 0,15 +

O 1 0,1
+

0,5 0,05

O 0 0
0 20 40 60 80 100 +
% EPOXIDOS MODIFICADOS

Suficientes grupos nuevos para favorecer la adsorción y muchos grupos epóxido fácilmente
accesibles para favorecer la inmovilización covalente.
 TERCERA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDOS

Curso Posgrado 2012

O HO
O
+ +
+ NH2
NH2 NH2
- NH2 NH2 -
pH 7 pH 7
-
HO -
O +
O
NH2 NH2 NH2
+ +
NH2 NH2

Incubación
a pH 10

Máxima densidad de grupos amino

Máxima densidad de epóxidos

Nuevo soporte comercial Resindion

Biomacromolecules. 2003. 4, 772-777.

Patente aplicada industrialmente por la empresa Resindion S.R.L. (200300428)

 UNA MISMA ENZIMA POR DIFERENTES REGIONES

Curso Posgrado 2012

BOLSILLO HODROFÓBICO
- -
- -
- - ZONA RICA EN HISTIDINAS
- -

++
++ ++
++

- -
- -

++
++
 CUARTA GENERACIÓN DE SOPORTES EPÓXIDO:INTERCAMBIADORES TIOL-DISULFURO

Curso Posgrado 2012

O O

pH 7
S S R SH S S

O O

Incubación
a pH 10
Grupos reactivos

 La mayoría de las proteínas no tienen cisteínas superficiales

 Podemos introducir cisteína en la región más conveniente
 Inmovilización dirigida de la enzima
 Posibilidad de rigidificación dirigida

Biotechnol Bioeng. 2005, 90, 597-605

Curso Posgrado 2012

Amplia gama de soportes

Epoxido heterofuncionales

Rigidificación de diferentes regiones de

la superficie de enzimas industriales

Derivados con muy alta actividad

y estabilidad
 SOPORTES GLIOXIL HETEROFUNCIONALES

Curso Posgrado 2012

NaOH

NaIO4
 INMOVILIZACIÓN EN TRES PASOS

Curso Posgrado 2012

NH3+
pH 7.0
NH3+

NH3+ Adsorción física NH3+

NH3+ ¨ 2
NH

NH3+
¨ 2
NH Incubación a pH 7

Incubación a pH 10
NH3+
NH3+

NH3+
¨ 2
NH

Inmovilización covalente
multipuntual muy intensa Inmovilización covalente
intramolecular suave
Curso Posgrado 2012

BTL2 inmovilizada en aminos sin groups glioxil (■); BTL2 inmovilizada en soportes
amino-glyoxyl a pH 8 durante 12 h (▲); BTL2 inmovilizada en amino-glioxil a pH 8
e incubada durante 3 horas a pH 10 (♦).
 Table 3: Immobilization of BTL on different glyoxyl supports.

Curso Posgrado 2012

Recovered Activity
Support Recovered Activity
Immobilized after incubation of
( pH of after
BTL (%) (A) adsorbed enzyme at
immobilization) adsorption (%) (B)
pH 10 (%) (B)
Chelate-glyoxyl
94 21 11
(pH 7.0)
Amino-glyoxyl
100 90 90
(pH 7.0)
Monofunctional
100 60 60
glyoxyl (pH 10.0)
Boronate-glyoxyl
95 71 67
(pH 7.0)

A.- percentage of soluble enzyme incorporated to the activated support.

B - percentage of activity regarding to the soluble enzyme
that has been incorporated to the activated support
Curso Posgrado 2012

SOPORTE ACTIVADO CONDICIONES EXPERIMENTALES ORIENTACIÓN DE LA ENZIMA

Glioxil monofuncional pH 10 Región más rica en lisinas

Glioxil monofuncional pH 8 Región con más de un amino terminal

Glioxil monofuncional pH 8 + compuestos tiolados (DTT) Región del amino terminal

Ionizado amino-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga negativa neta

Ionizado carboxi-glioxil pH 7 + baja fuerza iónica Región con mayor carga neta positiva

Metal quelato-glioxil pH 7; 200mM NaCl Región más rica en histidinas

Grupo hidrofóbico-glioxil pH 7; alta fuerza iónica Región más rica en residuos

hidrofóbicos
Baja densidad de grupos capaces de pH 7; baja fuerza iónica Región que expone la mayor superficie
adsorber y alta densidad de grupos
glioxil
 PROTOCOLO DE ACTIVACIÓN-INMOVILIZACIÓN

Curso Posgrado 2012 Activation of agarose gels with epiclorhydrine : glyceril-epoxy supports

Modification of epoxy groups with ligands bearing nucleophiles

Oxidation of glyceryl groups with periodate: glyoxil groups

Adsorption of enzymes at pH 7.0 ( through different regions) on different immobilized ligands

Long-term incubation at pH 7.0: mild intramolecular covalent immobilization with glyoxyl groups

Long-term incubation at pH 10: intense intramolecular multipoint covalent attachment

Mild borohydride reduction to stabilize amine-glyoxyl attachments

 DERIVADOS SIN SOPORTE
Curso Posgrado 2012

Todo el sólido es proteína

No hay gasto de soporte
Estabilización operacional
Rigidificación ?
Microambiente ?
Curso Posgrado 2012 POSIBILIDADES
Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates

CLECs CLEAs

Enzimas puras y cristalinas Enzimas con trazas de impurezas

Necesidad de enzima pura Coagregacion de enzimas

Estabilizacion de proteinas Agregacion de enzima y polimero

multimericas
Estabilizacion de enzimas
multimericas
 CLECs (Cross Linked Enzyme Crystals)
Curso Posgrado 2012

Entrecruzante

Ventajas:

- Alta actividad catalítica

- Posibilidad de estabilización de estructuras multiméricas

Inconvenientes:

- Necesidad de enzimas puras y cristalizables

- Necesidad de procesos sencillos de cristalización
 PREPARACIÓN DE CLEAs

Curso Posgrado 2012

precipitante
PEG
sales, disolventes

Agente
entrecruzante

CLEAs
Curso Posgrado 2012

Alta actividad Co-agregación

volumétrica de enzimas

No necesario
soporte

CLEAs
Co-agregación
enzimas-polímeros Estabilización
 Effect of dilution on the thermal stability of
CLEA from M. lysodeiktycus catalase
Curso Posgrado 2012
100

Actividad residual (%) 80

60 Clea1/10
Clea1/100
soluble1/10
40 soluble1/200

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 Las condiciones experimentales
fueron: 60ºC , pH 7,
Tiempo (h) 10000 IU/ml

Inmovilización convencional de enzimas: CLEA:

Disociación de subunidades es posible Disociación de subunidades no es posible
 AGREGADOS DE ENZIMAS Y POLÍMEROS:
CLEAS CON MICROAMBIENTES
Curso Posgrado 2012

Entrecruzamiento
Agregación

Estabilización frente a disolventes

• Estabilización frente a oxígeno

Biocatal. Biotransfor. 19, 489-503

 PENICILLIN G ACYLASE

Curso Posgrado 2012

0,8

0,6
e/eo

0,4

0,2

0
0 50 100 150 200 250 300 350

Time(hours)

Cinética de inactivación de CLEAs, a 4 ºC en 75 % (v/v) dioxano en 100

mM de tampón fosfato a pH 7.0.
 LENTIKATS
Curso Posgrado 2012

Usado normalmente con células

Enzima soluble escapa

 REPRESENTACION DE LA PRODUCCIÓN DE LENTIKATS® A PARTIR DE CLEA.
Curso Posgrado 2012

CLEA G PVA

Enzima soluble Enzima precipitada CLEA CLEA LentiKatsTM

PRECIPITACIÓN ENTRECRUZAMIENTO ENCAPSULACIÓN

Curso Posgrado 2012

1,2

0,8
e/eo

0,6

0,4

0,2

0
0 100 200 300 400
Time(hours)

INACTIVACIÓN POR CODISOLVENTE. Experimento hecho a 4

ºC en 75 % (v/v) dioxano y 25 % (v/v) 100 mM de tampón fosfato
a pH 7.0.
 ESTABILIZACIÓN DE NITRILASA USANDO
MICROAMBIENTES EN ATMÓSFERA DE OXÍGENO
Curso Posgrado 2012
OH
OH
Nitrilasa COOH
CN

100
Actividad, %

75

50

25

0
0 20 Tiempo, (h)
40

J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2006, 38, 154-57.

 DESARROLLO DE CLEAs

Curso Posgrado 2012

Permite obtener catalizadores muy activos

Estabilización de enzimas:
(multiméricas, disolventes, O2, etc)

Coagregación de varias enzimas

Coagregación de enzimas y polímeros