CROMATOGRAFÍA

Determinación
Separación
Historia
M. Tswett (1903)
Martin y Synge (1941)
La cromatografía es un método físico de separación en el
que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales es fija o estacionaria y la otra
móvil.

La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de

distribución de cada componente entre las dos fases.
FE FM
[A]FE
D= sólido gas
[A]FM
líquido líquido
gel fluido sc
Fundamento del proceso Forma de realizar dicho
cromatográfico proceso

tipos de técnicas
cromatografías cromatográficas
la naturaleza de las fases móvil y
dispositivo utilizado para
estacionaria y la clase de equilibrios
conseguir el contacto entre la
implicados en la transferencia de los
fase móvil y la estacionaria
solutos entre las fases, es decir, el
mecanismo de interacción
 Proceso por el cual la FM atraviesa la columna

Eluyente columna eluato

Velocidad de flujo (mL/min)

volumen de disolvente que atraviesa la columna
por minuto

Velocidad de flujo lineal (cm/min)

longitud de columna atravesada por el disolvente
en un minuto
Representa físicamente los espacios intersticiales
entre las partículas empaquetadas en la columna que
son accesibles a la FM, e incluye además los
V0 volúmenes internos del sistema
 Información analítica
relativa a la muestra
Representación gráfica de la respuesta funcionamiento del sistema
del detector en función del tiempo,
cromatográfico
volumen de eluyente o distancia en el
lecho cromatográfico

t0
intervalo de tiempo que transcurre desde
que el trazador es insertado al principio
del lecho cromatográfico hasta que sale
del mismo
tR
el tiempo que tarda el máximo de un pico en
ser eluido después de la inyección

t´R t'R = tR - to

diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la

columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna
comparado con un compuesto no retenido
 Es la relación entre el tiempo
que las moléculas del analito
están en la fase estacionaria y
el que están en la fase móvil.
k' = ( tR - to ) / to

K´
tiempo que el soluto pasa en la FE

CS VS K'= ß KD
tiempo que el soluto pasa en la FM C m Vm K'= ß D

tR = t0 (1 + K')

Pes y Pm, probabilidades que tiene un analito de estar en la FE o FM,

respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases:
Pes = K'/ 1+K' Pm es equivalente al denominado factor de
retraso, R,
Pm = 1/ 1+K' R = velocidad de desplazamiento del
analito/velocidad de FM = 1 / 1+K'
 volumen que ocupa en la columna la FM

V0 = t0F
volumen de FM necesario para que se
produzca la elución de un soluto

V= tF VR = tRF

V'R = t'RF

K' = V'R/V'0
VR = V'R + V0
VR = V0 (1 + K')
La longitud de una columna en la que el soluto experimenta
un equilibrio completo entre las dos fases

Eficacia de una separación cromatográfica

número de platos altura del plato
teóricos (N) teórico (H)

N = L/H

La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos

teóricos y menor la altura del mismo.
Una columna cromatográfica es más eficaz cuando menores son
los ensanchamientos de banda que origina

N = tR2/t2

N = 16 tR2 / Wb2

N = 4 tR2 / Wi2
= 5,54 tR2 / Wh2

2
41,7 (tR / W0,1 )
N=
 A 1,25 
 
B 
• velocidad finita a la cual el soluto alcanza el equilibrio
entre ambas fases
• la forma resultante de la banda depende
• velocidad de elución
• difusión del soluto a lo largo de la columna
• existencia de diferentes caminos que las diversas
moléculas de soluto pueden seguir cuando se mueven
entre partículas de la fase estacionaria.
estos efectos dependen de la velocidad con que la fase móvil
atraviesa la columna, y constituyen un mecanismo diferente de
ensanchamiento de banda cromatográfica.

Ecuación de van Deemter para la AEPT

 H = A + B/u + Cu
Existe una velocidad óptima
para operar con cualquier
columna, a la cual la AEPT
alcanza un valor mínimo
H = B/u + CS u + CM u
A, B y C son ctes características de un
sistema dado:
• coeficiente de difusión aparente
• coeficiente de difusión longitudinal
• coeficiente de transferencia de masa
H : cm
u: velocidad lineal de FM (cm/s)
B, CS, CM: ctes relacionadas con las
propiedades de la columna y del analito
Mecanismo diferente de
ensanchamiento de la banda
Define la capacidad de un sistema cromatográfico para distinguir entre
dos componentes.
Es una función termodinámica que depende de las distribuciones relativas
entre las fases móvil y estacionaria.
Se expresa mediante el factor de selectividad o retención relativa:

2,1 = t'R,2 / t'R,1 = k'2 / k'1

Para que una separación sea posible, es necesario que los valores de K´de
los componentes de la mezcla sean diferentes.
Cuanto más elevado es el valor de  , mayor es la selctividad de la FE, y
más fáciles las separaciones
Es un factor que se refiere a la capacidad de un sistema
cromatográfico para separar dos sustancias, teniendo en cuenta no
sólo la separación entre picos, sino también los anchos de la banda

Rs = 2(tR,2 - tR,1) / (wb,1 + wb,2)

Selectividad (), se relaciona con los valores

 - 1 k2 N de retención relativa y mide el poder
Rs = discriminatorio del sistema cromatográfico.
 1 + k2 4
Retención (k'), mide la fracción de eluito
presente en la FE y expresa el poder de
retención del sistema cromatográfico.

Eficacia (N), mide la estrechez relativa de los

picos mediante el número de platos teóricos
con que funciona la columna
 Objetivo conseguir picos bien definidos y separados en el menor tiempo
posible de análisis

variando las condiciones experimentales:

• velocidad de flujo,
• tamaño de partículas de soporte,
• temperatura de la columna,
• selección de fase móvil y estacionaria más adecuada,
• aumentando la longitud de la columna, etc
La ecuación de la resolución sirve de guía para elegir las condiciones que permitan
una buena separación: , K' y N pueden ajustarse más o menos
independientemente.

• modificar  y K’: variando la temperatura o la composición de las fases

• cambiar N modificando la longitud de la columna, y H variando el caudal de fase móvil, el
tamaño de partícula del relleno, la viscosidad de la fase móvil y el grosor de la película de
líquido adsorbido que constituye la fase estacionaria.
 Aumento del número de platos de la columna mejora la
resolución:
longitud de la columna, temperatura, tipo de analito,
caudal, tamaño de la muestra, técnica de inyección,
etc.
El resultado es un estrechamiento de las bandas con el
consiguiente aumento de la altura de las mismas; el
tiempo de retención prácticamente no se modifica.

• disminuir el tamaño de partícula del

relleno
• reducir la viscosidad de la fase móvil
líquida

Un aumento de K' generalmente aumenta la

resolución pero también el tiempo de elución.
Intervalo óptimo de valores de K’: 1 a 5.

•Con fases móviles gaseosas, K' puede

mejorarse aumentando la temperatura
•Con fases móviles líquidas, cambiando la
composición del disolvente.
 Un aumento en el factor de selectividad produce
un desplazamiento relativo de los máximos de las
bandas, con un rápido aumento de la resolución.
Los procedimientos para aumentar  sin
modificar significativamente K' son, por orden
decreciente de conveniencia:

1. cambiar la composición de la fase móvil incluyendo cambios en el pH (en

separaciones de ácidos o bases ionizables)

2. cambiar la temperatura de la columna, muy útil sobre todo en

cromatografía de cambio iónico

3. cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: disponer de varias columnas

fácilmente intercambiables

4. utilizar efectos químicos especiales; incorporar a la fase estacionaria una

especia que forme complejos o interaccione de otra forma con uno o más
componentes de la muestra.
Ejemplo: usar un adsorbente impregnado con una sal de plata mejora la
separación de olefinas debido a la formación de complejos entre los iones
plata y los compuestos orgánicos insaturados.
 Cromatograma Dato de información cualitativa

tR
Sustancia desconocida podemos
identificarla comparando su tR con el de un
patrón
dependen de una
variedad de
dividir la muestra en dos alícuotas: una de condiciones
ellas de cromatografía directamente, experimentales
mientras que a la otra se le adiciona una
cantidad dada de una sustancia patrón que
se sospecha existe en la muestra, y también
se cromatografía.
se obtiene conectando la línea de base de
cada lado del pico por medio de una línea
recta y midiendo la distancia perpendicular
entre esta línea y el pico
precisión razonablemente grande
sólo puede usarse cuando los picos son
agudos, estrechos y están bien separados.

mayor precisión: independientes de los

efectos de ensanchamiento debido a las
variables experimentales
integradores electrónicos digitales
estimación manual: triangulación,
planímetro, pesada
 %A = área del pico A/áreas x 100
Para que este método sea exacto, deben darse las
siguientes condiciones:
1. Todos los analitos deben ser eluidos
2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener la misma
sensibilidad

fx = fs (As/Ax) (wx/ws)

%X = (Ax fx)/(Ai fi) 100

 requiere un método muy reproducible
de introducción de la muestra

1. Debe eluir próximo a los picos de interés,

pero
2. Debe estar bien resuelto de ellos.
3. Debe ser químicamente similar a los
analitos y no reaccionar con ningún
componente de la muestra.
4. Como cualquier estándar debe estar
disponible en forma pura.