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PRESENTADO POR:
CÓDIGO: 108265699
HENRY MACIAS
CÓDIGO: 12122709
CÓDIGO: 1.085.253.029
CÓDIGO: 1062312351
CÓDIGO 4661417
TUTOR:
GEOVANNI RUEDA
ABRIL DE 2018
INTRODUCCIÓN
Por otra parte para el futuro profesional el artículo es un tema de interés en el campo
de desarrollo tecnológico y económico además del mejoramiento de procesos
tradicionales, que proporcionan herramientas para el uso de enzimas y
microorganismos usados en procesos industriales que conllevan a la creación de
nuevos productos, y de nuevos procesos, donde la biotecnología industrial se plantea
como una alternativa sostenible, que regula el impacto medioambiental de los procesos
biotecnológicos
LA PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEASA ASPÁRTICA DEL EXTRACTO DE
PROTEASA DE RHIZOPUS ORYZAE, PEPTIDAZE R
• CASEÍNA • N-ETILMALEIMIDA
• PEPSTATINA A • PEFABLOC
• ACIDO YODOACÉTICO • CLORURO DE SODIO
• Β- MERCAPTOETANOL • FOSFÁTO DE SODIO.
• FLUORURO DE • DODECILSULFATO DE
FENILMETILSULFONILO SODIO
METODOLOGIA
Productos químicos
Fluoruro de
Pefabloc SC, N- Acido
Caseína fenilmetilsulfon
La peptidasa R etilmaleimida yodoacético ß-
ilo (PMSF)
se adquirió de mercaptoetanol
Amano Enzyme y ditiotreitol se
Inc. (Nagoya, adquirieron de
Japón). Lipas Sigma-Aldrich
(St. Louis,
MO).
La proteína
purificada se
Las fracciones que concentró por
exhiben actividad ultrafiltración
proteasa aspártica usando un
La proteasa dispositivo de
aspártica se eluyó a se combinaron y se
dializaron frente a filtro centrífugo
El sobrenadante se un caudal de 1 ml / Amicon (corte de
min utilizando un tampón glicina-
aplicó a una HCl 50 mM, pH 10 kDa, Millipore)
columna HiTrap tampón de y se almacenó a
equilibrado con un 3,4, para el
Phenyl Sepharose almacenamiento. 4ºC
(GE Healthcare gradiente
Biosciences) descendente lineal
equilibrada con de sulfato de
tampón fosfato amonio del 100%
sódico 50 mM, pH (solución saturada)
7,0. al 0%
METODOLOGIA
Las concentraciones de
proteína se cuantificaron
utilizando un kit de
El peso molecular de la ensayo de proteínas Bio-
proteína se determinó Rad con albúmina de
usando el software suero bovino como
TotalLab (Nonlinear, patrón.
Las proteínas en el gel se
tiñeron con Bio-safe Durham, NC) de acuerdo
Coomassie Blue (Bio-Rad con las instrucciones del
Laboratories). fabricante
La homogeneidad de las
proteínas y el peso
molecular se
determinaron mediante
electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecil
sulfato de sodio (SDS-
PAGE) en geles de
separación de 5% y 12%
de separación, usando
marcadores de proteína de
amplio espectro (6,5-200
kDa; ) Como estándares
de tamaño.
METODOLOGIA
1.4. secuenciación de aminoácidos n-terminal
http://blast.ncbi.nlm.
La comparación de la secuencia nih.gov/ Blast.cgi
con secuencias codificantes de
proteasa similares en GenBank se
realizó usando la Herramienta de
Búsqueda de Alineación Local
Básica (BLAST) en el sitio web
del Centro Nacional de
Información sobre Biotecnología
(NCBI)
La alineación de secuencias
múltiples y las identidades http://www.ebi.ac.uk/
(%) se realizaron utilizando Tools/msa/clustalo/
Clustal Omega en el sitio web
del Instituto Europeo de
Bioinformática (EMBL-EBI)
INACTIVACIÓN DE LA PROTEÍNA
• La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 12,000 rpm y 4ºc durante 10 minutos.
• Incubación de la enzima purificada durante 65 minutos en tampón de glicina –hcl 50 mm, ph 3,4, a
35°cy a 45°c.
• La enzima purificada se incubo cada reactivo en tampón glicina – hcl 50 mm ph 3,4, a 35°c
durante 30 minutos.
• La enzima se ensayó para la inhibición de los inhibidores de serina proteasa pmsf (0,1 mm y
1mm) y peflaboc sc (1mm) y la aspártica inhibidor de la proteasa pepstatina a (1µm)
EFECTOS DE REACTIVOS QUIMICOS E IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
• Para determinar si la proteasa es dependiente del metal, se realizo un ensayo sobre la proteína
purificada después de la incubación con el acido etilendiamino tetraacetico (edta).
• La enzima purificada se incubo a 35°c durante 30 min en tampón de glicina-hcl mm, ph 3,4 con
edta 10 mm.
EFECTOS DE REACTIVOS QUIMICOS E IONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
• El edta se elimino por ultrafiltración centrifuga usando un dispositivo de filtro centrifugo amicon.
• El efecto de los metales divalentes añadidos a la enzima después de la eliminación del quelante con una
solución acuosa de cloruro metalico a una concentración final de 1mm durante 30min.
• EL PESO MOLECULAR DE LA PROTEÍNA SE DETERMINÓ USANDO EL SOFTWARE TOTALLAB (NONLINEAR, DURHAM, NC) DE ACUERDO
CON LAS INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE.
• LAS CONCENTRACIONES DE PROTEÍNA SE CUANTIFICARON UTILIZANDO UN KIT DE ENSAYO DE PROTEÍNAS BIO-RAD CON
ALBÚMINA DE SUERO BOVINO COMO PATRÓN.
PERFIL CROMATOGRAFICO
CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBA
RESULTADO Y DISCUSION
El avance científico y tecnológico ha permitido establecer que las proteasas son de relevancia puesto que participan
en procesos relacionados con el bienestar del hombre.
Se pueden dar casos donde la alteración de las enzimas y un mal manejo desencadenan diversas patologías y
trastornos.
El artículo elegido plantea que aspártico proteasas son una subfamilia de endopeptidasas que son útiles en una
diversidad de aplicaciones .
Aspártico proteasas son reactivos de mucha utilidad en la industria de procesamiento de alimentos, tema de gran
importancia para la carrera del ingeniero de alimentos.
Se utilizan como enzimas coagulantes de la leche para la fabricación de queso y como aditivos para mejorar el sabor
de los alimentos y la textura .
En las industrias de producción de alimentos la mayor parte de las enzimas utilizadas son proteasas por poseer
aplicaciones más prácticas y variadas. En la industria de los alimentos se utilizan como enzimas coagulantes de la
leche para la fabricación de queso y como aditivos para mejorar el sabor de los alimentos y la textura.
Es importante conocer sobre al purificación de esta enzima, y más que parte de una proteasa que es producida de
forma natural por el organismo, la cual tiene diversas funciones como producción de nutrientes, actúan en el
crecimiento celular y en la degradación de proteínas.