Tecnología de ADN

Karina Orozco
 ADN
• Es el material genético presente en todas
las células y algunos virus

¿Cómo lo estudiamos?
 Virus
• Fagos: infectan
bacterias (T-pares, l)
– Fago virulento: lítico
– Fago temperado:
lisógeno

• Grandes cantidades
en poco tiempo (1011
partículas de fago/ml
de cultivo bacteriano

• Genomas pequeños
 Pasos para estudiar el ADN
• Extracción de ADN
• Aislamiento de genes
• Selección de genes
• Amplificación o Clonación
• Estudios
– Secuenciación
– Mutaciones
Endonucleasas de restricción
• Enzimas que cortan al
ADN en lugares
específicos (secuencias
palindrómicas)

• Identificadas en bacterias
(defensa contra virus)

• Puede originar
fragmentos:
– Pegajosos
– Romos
 Ejemplos de Enzimas de Restricción
Enzimaa Fuente Sitio de
reconocimientob
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC
EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC
HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC
HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT
HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC
HpaII Haemophilus parainfluenzae CCGG
MboI Moraxella bovis GATC
NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC
SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC
TaqI Thermus aquaticus TCGA
aLa enzimas tiene el nombre de acuerdo a la especie de la que se aislaron, seguida de un número para
distinguir las diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (ej. HpaI and HpaII).
b Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia en una sola de las hebras del DNA. “N” representa

cualquier base
 Electroforesis
• Separación de los
fragmentos obtenidos
con endonucleasas
de restricción

• Visualización: se
tiñen (bromuro de
etidio) y fotografían
 Mapas de Restricción
• ADN se trata con diferentes endonucleasas de
restricción→diferentes tipos de corte.

• Útil para genomas pequeños (virus, plásmidos)

 Vectores de transferencia
• Medio de
transferencia para
clonación de genes

• Ej. Fagos, plásmidos,

BACs, YACs
 Características de los
vectores de transferencia
• Sitios de corte o de restricción para insertar el gen

• Un marcador para distinguir la célula transformada

• Replicación independiente para transmitir o multiplicar el

gen

• Se recuperan fácilmente de la célula huésped utilizando

la misma enzima de restricción usada en la inserción
 ADN recombinante
Molécula que contiene ADN de fuentes
diferentes
Moléculas de ADN de fuentes diferentes se
tratan con la misma endonucleasa de
restricción (digestión)

Los fragmentos obtenidos se insertan en el

vector de transferencaia y sellan con ADN
ligasa

Se obtiene el ADN recombinante y se

introduce a una célula (transformación o
transfección) para clonarlo o amplificarlo

Se seleccionan las células con el ADN

recombinante de interés (marcador)

Se identifican los clones que contienen el ADN

de interés (sonda radiactiva de ADN)
 Ejemplo de clonación con plásmidos
2. Inserción con DNA ligasa

1. Digestion con enzima

de restricción

3. Transformación de celulas huesped

4. Replicación de bacterias y plasmido

Manipulación más fácil que con fagos !

 ADN complementario (cDNA)
• Es una fuente alternativa
para clonar ADN de
interés

• Se utiliza ARNm (sin

intrones) como molde y
una transcriptasa inversa

• Puede obtenerse
bibliotecas de ADNc
(genes activos)
Ejemplo de aplicación de estas técnicas

• Producción de • Organismos
insulina humana genéticamente
modificados (GMO):
• Producción de – transgénicos o cisgénicos
hormona de
crecimiento humana
(antes se obtenía de
cadáveres)

• Vacunas (hepatitis B)
 PCR
• Reacción en cadena • Reactivos:
de la polimerasa – Taq polimerasa
(polimerasa
termorresistente)
• Método más rápido – dNTP´s
para aislar y clonar
– Primers (cebadores)
(amplificar) ácidos para iniciar síntesis de
nucleicos DNA

• En un termociclador
Secuencia de pasos en PCR

95ºC:
Desnaturalización
de ADN

60ºC:
72ºC: Unión de primers a
Replicación por la las regiones
Tac polimerasa terminales del gen
de interés
 Secuenciación de ADN
• Determinar el
orden lineal de las
bases en el ADN

• Método de Sanger
– Utiliza
dideoxinucleótidos
– Separa
fragmentos por
electroforesis
 Genomas
• Se han secuenciado • 1-2% genoma
varios genomas humano codifica
(humano 2003) proteínas
normalmente
• Evolución, fisiología y
enfermedad
• ¿Qué proteínas se
producen, cómo
• ¿Cuántos genes?
funcionan e
¿Cuándo y en qué
interactúan con
tejidos se expresan?
otras? Proteómica
 Genomas
• La secuencia de • Utilidad: base
bases entre genética de
individuos solo difiere enfermedades:
un 0.3% – Cáncer de colon y
mama
– Diabetes
• Variaciones: SNPs o
– Alzheimer
polimorfismos de un
único nucleótido
 Microarreglos o chip de ADN
• Permiten monitorear
simultáneamente la
expresión de miles de
genes (25000)

• Utiliza sondas de ADN

(gen individual)

• Se hibrida con ADNc

• Patrones de expresión de
genes
 Utilidad del microarreglo
• Expresión diferencial de genes
(sanos/enfermos, mutantes/salvajes,
tratados/no tratados).
• Clasificación molecular en
enfermedades complejas.
• Genes característicos de una
patología
• Predicción de respuesta a un
tratamiento.
• Detección de mutaciones y
polimorfismos de un único gen
(SNP).
 FISH
• Sonda de ADN
radiactiva se hibrida
con ADN
desnaturalizado

• Diagnóstico:
evidencia una
mutación puntual o
deleción