UD 3.

azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

Miriam Aguado Atorrasagasti

UD 3.1. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
- Erauzketa eta arazketaren lehen etapa → mintzak

- Azido nukleiko araztuak lortzea

- I. Laginaren aurretratamendua
- II. Azido nukleikoen erauzketa
- III. Azido nukleikoen arazketa
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
- Abiaburuko materialaren aniztasuna eta aldakortasuna

- Suspentsio zelularrak: bitarteko likidoaren sinuan

sakabanaturik flotatzen duten zelula askeak eta agregatu
zelularrak.
- Odola
- Kultibo zelularrak
- Animali ehunak edo landare freskoak
- Formolean finkatutako ehunak eta parafinan txertatuak
- Beste lagin batzuk: karkaxak, ahoko mukosako zelulak, bakterioak,
legamiak...
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
ODOLA (Hematiak+leukozitoak+plaketak)

Arazketa leukozitoetatik abiatuta

HEMO taldea PCRaren inhibitzaile

ahalduna da. Hematien LISIS bidez
hemoblobina desagerraraztea
garrantzitsua da.
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
LAGINA LORTZEA ETA KONTSERBATZEA

- Antikoagulatutako odola guztira EDTA (zitratoa edo

heparina ok)
- DNA erauzketa 24 ordu. (4ºC errefrigeratua 5 egun).
- Southern blot-erako ez kontserbatu 3 egun baino gehiago.

HEMATIEN LISISA

1. Hematien lisia (tamp 1:3)

2. Lagina zentrifugatzea (pellet)
3. Gainjalkina desagerraraztea (Hb)
4. Jalkina kontserbatzea (leukozitoak)
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
ODOL PERIFERIKOKO ZELULA MONONUKLEATUAK LORTZEA

- Birusa: GIB, birus linfotropikoak

- Isolatu PMBC (odol periferikoko zelula mononukleatuak)
- Dentsitate gradientean zentrifugatzea

Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Processing

3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
KULTIBO ZELULARRAK

- Helburua: invitro zelulak lortzea ereite kontrolatuen

bidez.

- KULTIBO ESEKIAK (hodia)

- GERUZA BAKARREKO KULTIBOAK (flaskoa)
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
ANIMALI EHUNAK EDO LANDARE FRESKOAK

Helburua: NA lortzea animali/landare ehun freskoetatik

abiatuta

HOMOGENEIZAZIOA: ehun bati egiten zaion tratamendua osatzen

duten zelulak askatzeko.

- HOMOGENEIZAZIO MEKANIKOA
- Automatikoa: birringailu urratzailea xehatzeko
- Eskuzko almaiza: nitrogeno likidoa+almaiza+erauzketa
- Kimika: inkubazio nahasketa+tenperatura+erauzketa
3.2. lagin biologikoen aurretratamendua
FORMOLEAN FINKATUTAKO EHUNAK ETA PARAFINAN TXERTATUAK (FFPE)

DESPARAFINAZIOA

Ehunetatik parafina desagerraraztea

(ikus 3.3. dok.)

BESTE LAGIN BATZUK

Bakterioen eta legamien kultiboak

Ahoko mukosaren zelulak

Karkaxa
3.3. azido nukleikoen erauzketa
ERAUZKETA PROZESUAK: itxura homogeneoko lisatu zelularra
lortzean datza, isolatuak mantentzen zituzten egituretatik
aske dauden NAekin

- Lisi zelularra
- Nukleasen inaktibazioa
3.3. azido nukleikoen erauzketa
3.3.1. LISI SOLUZIOA

- Detergenteak
- EDTA
- Proteasak
- Agente kaotropikoak
3.3. azido nukleikoen erauzketa
3.3.2. HORMA ZELULARRA DUTEN ZELULEN TRATAMENDUA

- Tratamendu entzimatikoa
- Tratamendu mekanikoa
- Tratamendua CTABrekin
3.3. azido nukleikoen erauzketa
3.3.3. LISIAREN EMAITZEN EGIAZTAPENA

- Egiaztatu soluzio homogeneoa lortu dela

- Lisi homogeneoa lortu ez bada: lisi soluzioa gehituko
dugu eta berriz ere inkubatuko dugu.

3.3.4. DNAren ERAUZKETAN AINTZAT HARTU BEHARREKOAK

- RNA desagerraraztea: RNAasaA gehituko dugu eta 37ºCtan 15-

45 min inkubatuko dugu. Adb: listua.
3.4. azido nukleikoen arazketa
NAren arazketa: NA-a lisatuaren gainerako osagaietatik
bereiztean datza.

- Arazketa disolbatzaile organikoekin

- Prezipitazioa gatzekin (salting-out)
- Elkartruke ionikoko kromatografia
- Adsortzio kromatografia
- Arazketa esfera magnetikoen bidez
- Ultrafiltrazioa
- Plasmidoen arazketa (praktiketan ikusiko dugu)
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Arazketa disolbatzaile organikoekin
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Prezipitazioa gatzekin (salting-out)

https://www.youtube.com/watch?v=rhfkVdqdE7w
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Elkartruke ionikoko kromatografia

https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Adsortzio kromatografia
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Arazketa esfera magnetikoen bidez

https://www.youtube.com/watch?v=aqSz56UHFxY&list=PLqrNWo_056c
ZW9PgwPaOtkAWX8TYIZtfj
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Ultrafiltrazioa
3.4. azido nukleikoen arazketa
- Plasmidoen arazketa (praktiketan ikusiko dugu)

Plasmidoen arazketa lisis alkalino bidez egiteko protokoloa

(Mini-prep)
3.5. erauzketa/arazketa prozesuaren automatizazioa
AUTOMATIZAZIOAREN ABANTAILAK

- Altuki araztutako NAk lortzea bermatzen du

- Proteinen kutsadura minimizatzen du
- Laginen kutsadura gurutzatua eragozten du
- Azkartasuna ematen du (< 1 ordu)

INTRUMENTU AUTOMATIKO MOTAK

- Partikula magnetikoetan oinarrituak

- Adsortzio kromatografian oinarrituak

- Instrumentu modularrak
3.6. azido nukleikoen kalitatea
Kalitatea zehazten duten parametroak:

- Integritatea: NA batek bere jatorrizko tamaina gordetzen

duen zehazten du
- DNA gemonikoa
- DNA plasmidikoa
- RNA
- Purutasuna: balizko kutsatzailerik ez dagoela zehazten du
- A260/A280 zatidura, A260/A230 zatidura, 320nm absorbantzia
- Kontzentrazioa: NA zenbatekoa amaierako soluzioaren
bolumen unitateko. (ikus unitateen konbertsioa)
- Absorbantzia 260 nm
- NA kontzentrazioa = (A260-A320) x diluzio faktorea x konbertsio
faktorea
- Fluoreszentzia
- Araztutako NAen funtzionaltasuna
3.7. azido nukleiko araztuen biltegiratzea
LAGINAREN INTEGRITATEA GORDETZEKO BALDINTZAK

- Eppendorff itxitura hermetikoa eta DNAasa eta RNAasa

gabeak
- Hotzean biltegiratzen dira (-20ºC eta -80ºC)
- Izozkailuen segurtasun sistemak

LAGINEN TRAZABILITATEA

- Hodien zuzeneko errotulazioa

- Etiketa kodedunen erabilera (-80ºC-tan irauteko modukoak)